微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇

微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇二.微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线三.提高内生菌紫杉醇的产量的方法一、紫杉醇的概况和作用机制红豆杉树一、紫杉醇的概况和作用机制紫杉醇（Paclitaxel,商品名Taxol）的概述：1963年美国化学家瓦尼（M.C.Wani）和沃尔（MonreE.Wall）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（PacificYew）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。1971年Wall和Wani将粗提物进行纯化，并确定了其化学结构（一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol））。2001年HuangQ等通过实验获得紫杉醇生物合成的重要中间产物紫杉二烯(Taxadiene,产量达13mg/L),成为基因工程菌合成紫杉醇中间体的先例。紫杉醇发现到临床应用大约经历了30年的时间。注：紫杉醇是一种复杂的具有抗癌活性的三环二萜类生物碱。紫杉醇的作用机制它作用于细胞微管，通过与微管蛋白N端第31位氨基酸和217~231位氨基酸结合，诱导和稳定微管蛋白聚合，抑制其解聚，增加聚合程度，使维管束不能与微管组织中心相互连接，将细胞周期阻断于G2/M期，导致有丝分裂异常或停止，阻止癌细胞增殖或肿瘤体积逐渐缩小。那么人们根据紫杉醇作用机制，研究出来紫杉醇能治疗什么疾病呢？紫杉醇的临床作用紫杉醇有抗肿瘤、抗癌作用。可治疗卡波济氏肉瘤(一种艾滋病人特有的恶性肿瘤)、直肠癌、膀胱癌和转移性乳腺癌等一系列的棘手肿瘤；可治疗卵巢癌、肺癌。紫杉醇具有抗类风湿性关节炎、抗疟的作用,对中风、早老性痴呆和先天性多囊肾病、头部和颈部肿瘤、恶性黑色素癌和肉瘤等,均展现出一定疗效。紫杉醇还可诱导细胞凋亡,另外还有类似脂多糖(LPS)的作用,可调节机体的免疫功能。有人估计，治疗一个卵巢癌患者需要6棵树龄60~100年的红豆杉树。但紫杉醇已经广泛使用,并成为抗肿瘤的主流药物之一。对紫杉醇的需求越大，对红豆杉树和环境都会造成严重的伤害。后来，人们发现了微生物发酵法二微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线•实验材料罗汉松的树皮•实验方法1内生真菌分离2内生真菌纯化、鉴定与保存3发酵培养4发酵产物的处理（紫杉醇的提取、纯化、含量测定）1内生真菌分离•1）对植物组织表面进行消毒,以控制表生真菌的生长,使内生真菌得以分离。其分离方法是先用水冲洗已剪碎的植物材料,然后在75%乙醇中浸泡3min后,最后用无菌水冲洗。•2）分离所用的培养基为PDA培养基。为了防止细菌污染可在培养基中加抗菌素,如链霉素、四环素等。温箱中28℃培养3-4d后观察.•在分离内生真菌时常添加一些宿主植物的提取液，以满足内生真菌的一些特殊的营养需求2内生真菌纯化、鉴定与保存待培养基上初步长出菌落后，选择长势较好的菌落，挑取菌丝到PDA平板上纯化，根据经典形态学方法鉴定菌种。纯化的菌株在PDA斜面4℃下保持，备用。3发酵培养•从PDA平板上切取5mm×5mm小块菌落,接种至装有150mL液体培养基的500mL三角瓶中,于28℃,100r/min摇床上振荡培养10-14d.4发酵产物的处理1）紫杉醇的提取•常用的有机溶剂：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等•提取原则：能够充分萃取出发酵液和菌丝中的紫杉醇•具体方法：•发酵液过滤后,菌丝研磨（加适量石英砂），滤液称量体积。•滤渣烘干(低于50℃),滤渣用适量乙酸乙酯萃取,滤液用1/2滤液体积的乙酸乙酯萃取(30min),下层水层再用乙酸乙酯萃取一次,合并乙酸乙酯,减压蒸馏。•用适量甲醇洗涤减压蒸馏得到的固体,再用正己烷洗涤15min,收集下层甲醇,加入乙酸乙酯和水(1：1)进行萃取(30min),将收集的乙酸乙酯进行减压蒸馏,用一定量的乙腈洗下固体,0℃密封保存。•2）紫杉醇的纯化紫杉醇的纯化多采用色谱法。已报道的用于紫杉醇分离的方法除薄层色谱法、柱层析法外还有胶束电动毛细管色谱法、高速逆流色谱法、树脂吸附分离法、膜分离法、沉淀法、化学反应法和药理作用靶点法。•3）紫杉醇含量测定真菌发酵液中紫杉醇的定量可采用薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、UV免疫分析、生物学方法和放射性前体标记等。高效液相色谱(HPLC)•HPLC是最常用的、较为有效的分析检测方法。HPLC不仅可以测定紫杉醇含量,而且还能追踪分离紫杉醇。•色谱条件：惠普1100系列，采用XDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇与水混合物(V甲醇:V水=65:35)，柱温为25℃，波长为227nm，流速1.0mL/min，进样量10μL。用紫杉醇标准品做对照。•预期结果•从罗汉松树皮中成功筛选出一株产紫杉醇的内生真菌菌株。微生物发酵法生产紫杉醇的优势•内生真菌能在简单的培养基上良好生长•产生大量的发酵产物•发酵周期短•可以在生物反应器中人为控制各种参数•可通过诱变育种等手段来提高菌种性能，以提高紫杉醇产量微生物发酵法生产紫杉醇面临的困境•（1）缺乏良好的适合发酵的工业菌株•（2）由于发酵条件的限制，单位培养液中紫杉醇的含量低三提高内生菌紫杉醇的产量的方法（一）改良菌种1.利用常规的诱变改良菌种2.利用原生质体融合改良菌种3.利用基因工程构建工程菌分离紫杉醇合成代谢酶类和获得它们的cDNA克隆，将已经构建的携带紫杉醇合成途径关键酶基因的真菌表达载体转入高产紫杉醇内生真菌中，获得高产紫杉醇工程菌株（二）优化发酵条件1.培养基和培养条件的优化依据不同产紫杉醇真菌的生长条件，选择合适的培养基，发现最佳发酵条件，以期提高紫杉醇的产量2.添加紫杉醇合成的前体物质加入前体一方面可通过增加底物量来加快反应速度和提高产率，另一方面还能够反馈抑制分支路径而促进反应顺利进行，有效提高紫杉醇产量。如：钠不仅能掺入到乙酰基，而且能掺入到苯环及紫杉烷骨架中，是紫杉醇合成的有效前体（二）优化发酵条件3.添加代谢产物的抑制剂真菌的次生代谢产物十分丰富，估计有3,000多种，如果研究清楚紫杉醇与其他次生代谢物之间合成关系，对人为抑制其他次级代谢物的合成，能有效促进紫杉醇的生物合成量4.添加诱导物诱导子是一类可以引起代谢途径改变或强度改变的物质，包括植物激素、无机离子、多糖、真菌培养物等（三）与“前提内生真菌”一起培养如产紫杉醇合成前体10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III的内生真菌