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L/O/G/O基因打靶的里程碑事件——ZFN、TALEN、CRISPR-CaS姓名：邢亚迪专业：作物遗传育种导师：何光华教授任何对基因进行特异性修饰的工具都是由两个部分组成：1DNA特异性识别结合域2核酸内切酶活性区域ZFN=DNA识别域+核酸内切酶TALEN=DNA识别域+核酸内切酶CAS9=DNA识别域+核酸内切酶ZFN原理ZFN=DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：由一系列Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3~4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA。TALEN=DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：由一系列TAL蛋白串联组成（一般20个左右），每个TAL蛋白识别并结合一个对应的碱基。核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNATALEN的定义及原理TALE（Transcriptionactivator-likeeffectors）:一种源于植物致病菌的靶向基因操作技术。科学家发现，来自植物细菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。全长为34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基。NG可以识别THD可以识别CNI可以识别ANN可以识别G或A通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组装在一起，再加上FokI核酸内切酶，就可以构成可以识别目的片段的Tale蛋白。TALEN的特异性打靶的原理：一对可以特异性识别靶基因的TALE，定位到需要编辑的基因组区域；然后非特异性核酸内切酶Fok1切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（double-strandbreak，DSB）；再通过DNA的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。Fok1只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。TALEN介导的基因敲除TALEN质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALEN融合蛋白中的FokI临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA。TALEN介导的同源重组形成DSB时，同源重组可将需要敲入的序列组合如基因组。TALEN的技术特点•任意敲除，无基因序列、细胞、物种限制，永久失活•成功率高，在保证转染效率的前提下，有效性可达95%以上•打靶效率高,可完全替代RNAi技术•脱靶率低，尚未发现明显脱靶效应•周期短，只需按照常规构建质粒方法构建Talen质粒CRISPR-Cas系统•CRISPR序列：细菌和古细菌中发现的很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences）。•Cas：CRISPR相关基因（CRISPR-associatedgenes）CRISPR-Cas系统是细菌的免疫系统：CRISPR序列能特异性识别外源核酸序列；Cas蛋白的非特异性核酸内切酶功能将外源核酸切断。两个质粒，一个表达Cas9蛋白，一个表达sgRNACRISPR-Cas9=DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：向导RNA核酸内切酶：Cas9核酸内切酶引导RNA由两部分组成：CRISPRRNA(crRNA)和反式作用CRISPRRNA（transactingCRISPRRNA,tracrRNA)crRNA一端与双链核苷酸互补结合，另一端与tracrRNA互补结合，形成向导RNA。PAM：NGG•Cas9蛋白与向导RNA结合、组装的动作是这套位点特异性的基因组修饰过程里的限速步骤。•PAM序列为５’－ＮＧＧ－３’靶序列后面必须为ＮＧＧ才能被向导ＲＮＡ识别。CRISPR-Cas系统靶向要求：PAM序列PAM序列只有３个碱基：ＮＧＧ。靶序列后面必须为ＮＧＧ才能被向导ＲＮＡ识别。在人类基因组中平均每８个碱基就可以出现一个ＮＧＧ最近有研究发现，crRNA和tracrRNA可以被“改装”成一个向导RNA（single-guideRNA,sgRNA）。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。而且可以将sgRNA和Cas9装在同一个表达质粒中表达。这种RNA介导的Cas9酶切作用能够在多种类型的细胞和生物体内正常地行使功能，在完整基因组上的特定位点完成切割反应。CRISPR-Cas系统优势•ZNF成本高昂，效率低。•Cas9的效率是TALEN的5倍。•sgRNA全长不超过100bp，构建更容易L/O/G/OThankYou!