生物学仪器分析及实验技术-显微

显微镜技术显微摄影技术掌握常用显微镜的结构及性能特点熟悉显微技术的基础理论，显微镜的应用了解显微镜的维护教学基本要求内容提要第一节光学显微镜第二节光学显微镜的分类及其应用第三节电子显微镜第四节显微镜的维护、常见故障及排除第五节显微摄影技术第一节光学显微镜一、光学显微镜的工作原理二、光学显微镜的基本结构三、光学显微镜的性能参数四、像差和色差五、光学显微镜的不足之处一、光学显微镜的工作原理显微镜是由两组会聚透镜组成的光学折射成像系统。把焦距较短、靠近观察物、成实像的透镜组称为物镜（objectlens），而焦距较长，靠近眼睛、成虚像的透镜组称为目镜（ocularlens）。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第一级放大后成一倒立的实像，然后此实像再被目镜作第二级放大，得到最大放大效果的倒立的虚像，位于人眼的明视距离处。光学显微镜的工作原理图①机械部分：镜座、镜柱、镜臂、镜筒、调焦装置、载物台、物镜转换器②光学部分：目镜、物镜、反光镜、聚光镜放大倍数：目镜的放大倍数×物镜的放大倍数二、光学显微镜的基本结构三、光学显微镜的性能参数(一)放大率(二)数值孔径(三)分辨率(四)视野(五)景深与焦长(六)镜像亮度和清晰度(七)工作距离(一)放大率显微镜的放大率(amplification)或称放大倍数是指显微镜经多次成像后最终所成(放大的)像的大小相对于原物体大小的比值，常记作M。M=maqM是显微镜的总放大倍数；m是物镜的放大倍数；a是目镜的放大倍率，一般表达为明视距离(正常视力者为25cm)与目镜焦距之比；q为在双目显微镜中所增设的棱镜所起的放大倍数，一般取值为1.6倍。(二)数值孔径数值孔径(numericalaperture)又叫镜口率，是物体与物镜间媒质的折射率N与物镜孔径角的一半(α/2)正弦值的乘积，通常缩写为NA，即NA=N*sin(α/2)显微镜的数值孔径与其放大率成正比，与分辨率、景深成反比，它的平方与图像亮度成正比。NA=N*sin(α/2)最高数值孔径油浸物镜较高数值孔径干物镜低数值孔径干物镜油油(二)数值孔径分辨率：显微镜的最重要参数，能够区分开两个质点的最小距离。D=0.61λN•sinα/2D：分辨率λ：光波的波长N：介质折射率α：物镜镜口角N与D成反比，λ与D成正比(三)分辨率提高显微镜分辨率的方法（1）增大物镜的数值孔径在物镜和盖玻片之间充以n较大的油，如香柏油n=1.52，不仅使n增大，而且孔径角也增大。（2）用短波长的光照射如紫外光显微镜，电子显微镜。(四)视野视野(visualfield)又称视场(field)，是指通过显微镜所能看到标本所在空间的范围。(五)景深与焦长景深(depthoffield)又称焦点深度，是指在成一幅清晰像的前提下，像平面不变，景物沿光轴前后移动的距离称“景深”。景物不动，像平面沿光轴前后移动的距离称“焦长”。(六)镜像亮度和清晰度镜像亮度即显微镜的图像亮度的简称。高倍率工作条件下的暗场、偏光、摄影显微镜等都需要足够的亮度，与照明及物镜的性能参数相关。镜像清晰度是指图像的轮廓清晰、衬度适中的程度。(七)工作距离工作距离是指从物镜前表面中心到被观察标本间满足工作要求的距离范围，与物镜的数值孔径成反比。一般情况下，物镜的数值孔径赿大，其工作距离赿小。四、像差和色差(一)、像差1．球差(sphericaberration)2．彗差(broomaberration)3．像散(astigmatism)4．场曲5．畸变(distortion)(二)、色差(一)、像差(aberration)像差是指透镜所成的像与理想像在形状、颜色等方面存在差异。1．球差(sphericaberration)透镜的球差光轴上的点光源所发出的光锥入射到透镜的球折射面时，由于通过透镜边缘的光线不满足近轴光线的条件，因此不能和通过近轴曲面的光线会聚成一个理想的亮点，而是形成一个中间亮边缘逐渐模糊的弥散斑，这就是透镜的球面像差，简称为球差。球差可以通过设置光阑而减小。2．彗差(broomaberration)近光轴外的点光源发出的光束，经过透镜中央和边缘部分后在垂直于光轴的同一成像平面上也不能交于同一个像点。离光轴越近的像会聚越好，亮度越大，亮点越小。于是在成像平面上便形成一个顶端小而亮，远离光轴方向形成逐渐增宽且亮度减弱的模糊尾部，形如彗星，称为彗差。透镜的彗差光轴透镜3．像散(astigmatism)远离光轴的物点发出的光，即使是以细光束成像也不可能会聚于一点，而是在像空间不同的成像面上或者成椭圆弥散斑，或者在特殊位置形成圆形弥散斑，甚至是形成两个垂直方向上的短亮线，这种成像缺陷称为像散。一般来说，透镜像散随透镜形状、光阑位置而异，可以用正、负透镜适当组合而消除。透镜的像散物点物镜光轴水平焦平面垂直焦平面明晰圆4．场曲一个平面的物体通过透镜成像后，虽然像平面上任意一点仍然是清晰的，但所成的像不再是一个平面，而成了一弯曲的面，这就是场曲。5．畸变(distortion)由于像平面上各处放大率不同引起的成像缺陷称为畸变。畸变的原因是由于透镜边缘与透镜近轴的放大率不同而引起的。如果离光轴越远处放大率越大，则像的外部线段将比中间线段长，结果形成了枕形畸变，这种畸变称为正畸变。反之则形成边缘放大率小而近轴放大率大的桶形畸变，称为负畸变。透镜的畸变(二)、色差色差(chromaticaberration)是一种由白光或复色光经透镜成像时，会因各种色光存在着光程差而造成颜色不同、位置不重合、大小不一致的不同成像效果，从而造成像和物的较大失真。透镜的色差透镜的轴向色差(Ａ)和垂轴色差(Ｂ)ＡB五、光学显微镜的不足之处1、放大倍数的极限：20002、分辨率的极限：0.2m（可见光照明）3、景深的极限：0.1m4、不能分析化学成分第二节光学显微镜的分类及其应用一、双目生物显微镜二、荧光显微镜三、相衬显微镜四、倒置显微镜五、暗场显微镜六、偏光显微镜七、激光扫描共聚焦显微镜一、双目生物显微镜双目显微镜(binocularmicroscope)的结构是利用一组复合棱镜把透过物镜后的光束分成强度相同的两束而形成两个中间像，分别再由左右目镜放大。来自物镜的光线经棱镜组分光成两束平行光束，进入目镜，双目显微镜必须满足分光后两束光的光程必须相同和两束光的光强度大小一致这两个基本要求。目镜物镜聚光器光源一、双目生物显微镜二、荧光显微镜荧光显微镜(fluorescencemicroscopy)是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产生能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜。利用它可研究荧光物质在组织和细胞内的分布。为防止紫外线进入物镜，可以采用暗视场照明。荧光（Fluorescence）：细胞中的某些物质（如叶绿素）经紫外线照射后能发出可见光线，称为荧光。自发荧光：由细胞本身存在的物质经紫外线照射后发出的荧光。诱发荧光：一些细胞成分本身经紫外线照射后不发荧光，但用荧光染料（酸性品红、甲基绿、吖叮橙等荧光色素）进行活体染色或固定后切片染色，就能在荧光镜下看见荧光，这种荧光叫诱发荧光。二、荧光显微镜荧光显微镜的种类A透射式B落射式荧光显微镜的主要部件透射式•汞灯光源•激发滤色镜•暗场聚光镜•吸收滤色镜落射式•汞灯光源•激发滤色镜•分色镜•吸收滤色镜吸收滤色镜暗场聚光镜激发滤色镜汞灯箱透射荧光显微镜的构造落射荧光显微镜的构造吸收滤色镜激发滤色镜分色镜汞灯紫外线保护罩孔径光栏（FS）视场光栏（AS）目镜吸收滤色镜物镜暗场聚光镜激发滤色镜汞灯透射荧光显微镜原理落射荧光显微镜原理三、相衬显微镜相差显微镜是荷兰科学家Zernike于1935年发明的，用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化（振幅差），这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的区别是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。相衬显微镜比普通光学显微镜多了2个部件：在聚光器上增加一个环形光阑；在物镜后焦面增加一个相板，相板上有一个环形区，通过环形区的光比从其它区域透过的光超前或滞后1/4λ，这样就使通过标本不同区域光波的相位差转变为振幅差。三、相衬显微镜相衬显微镜照明原理四、倒置显微镜倒置显微镜(InvertedMicroscope)的组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。倒置显微镜五、暗场显微镜暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）的聚光镜中央有档光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4nm~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。暗视野照明方式六、偏光显微镜偏光显微镜是利用光的偏振特性，对具有双折射性(即可以使一束入射光经折射后分成两束折射光)的晶体、液晶态物质进行观察和研究的重要光学仪器。利用它可以清楚地观察到纤维丝、纺锤体、胶原、染色体、卵巢、骨骼、毛发、活细胞的结晶或液晶态的内含物、神经纤维、肌肉纤维、植物纤维等的细微结构，从而可以分析细胞、组织的变化过程。偏光显微镜是在一般显微镜的基础上增添了使普通光转变成线偏振光和检测偏振光的装置或观察干涉图样的特殊透镜。即光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的起偏器）。六、偏光显微镜偏光显微镜的载物台是可以旋转的。当载物台无样品时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线。而放入旋光性物质后，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。六、偏光显微镜偏光显微镜的结构七、激光扫描共聚焦显微镜激光共聚焦扫描显微镜（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量,配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。激光扫描共聚焦显微镜原理图七、激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜实物图1.激光扫描共聚焦显微镜工作原理激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。1.激光扫描共聚焦显微镜工作原理共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，由于照明孔与检测孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面以外的点不会在检测孔处成像，这样就得到了标本清晰的光学切面图，克服了普通光镜图像模糊的缺点。在显微镜载物台上加一个微量步进马达，使载物台上下移动，改变焦平面，不同层次的光切面图像经计算机图像三维重组，就能获得样品的立体结构图像。1.激光扫描共聚焦显微镜工作原理2.激光扫描共聚焦显微镜的基本结构1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像2.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片3.增加侧向分辨率4.由于点对点扫描去除了杂散光的影响3.共焦显微镜与传统显微镜的区别第三节电子显微镜光镜分辩极限为0.2m，小于0.2m的微细结构的光波可产生衍射现象,这种光波经过物体时可绕过物体就象无物体经过一样,因此无法用光镜观察。这就需要一种更大分辫力的仪器来观察比0.2m更小的物体的微细结构。光