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第四章遗传工程小鼠主讲教师：侯晓林博士北京农学院教授转基因与转基因动物转基因超级鼠1982年，英国的《自然》杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2～3倍，体积大一倍。遗传工程动物明星•多利——世界上第一只用已经分化的成熟的体细胞(乳腺细胞)克隆出的羊遗传工程动物明星•乙肝小鼠——持续表达乙肝病毒表面抗原的转基因小鼠。•将乙型肝炎病毒基因注入小鼠受精卵，整合进基因组，让乙型肝炎病毒在小鼠体内生存，并代代相传•乙型肝炎的病因•发病机理及防治•药物筛选•疫苗验证遗传工程动物明星•荧光鼠——取小鼠早期囊胚，注射转染了绿色荧光蛋白基因的小鼠胚胎干细胞后植入代孕母鼠子宫内一、转基因小鼠技术的发展史转基因小鼠技术兴起于60年代，至80年代中期逐渐成熟。其中关键的技术是实现外源基因的导入及整合，这一技术的发展到目前已经历了四个阶段：1.实现外源基因的导入。2.实现外源基因的定点整合-基因打靶。3.实现外源基因的组织特异性表达。4.实现外源基因的时间可控性表达。第一阶段：实现外源基因的导入1974年，Jaenisch等用显微注射法将SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵中的转移并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。SV40超级小鼠的建立1982年，美国学者Palmiter将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵，所生7只子代小鼠中有6只生长加快，体重明显增加，这就是所谓的“超级小鼠”(supermouse)诞生了(Palmiteretal.,1982:Nature,Vol.300,December16,1982)。“超级小鼠”的建立成功轰动了整个生命科学界，科学家们对此表现出浓厚的兴趣，许多实验室竞相开展这方面的研究工作，因此，转基因小鼠技术迅速发展，不断完善。第二阶段：转基因的定点整合。1987年，美国北卡罗莱纳大学Smithies和犹他大学Capecchi领导的研究小组根据同源重组的原理，实现了导入的外源基因的定点整合，这一技术亦称为“基因打靶”(Genetargeting).基因打靶技术的应用，一方面可以使导入的外源基因定点整合于人们希望整合的部位，从而避免了外源基因随机整合对内源基因的影响。另一方面，人们还可以利用基因打靶技术定点灭活一个内源基因，亦称为“基因敲除”(Geneknockout)。因此基因打靶技术为在整体水平研究某一基因的功能以及进行基因治疗开辟了新的途径。转基因的组织特异性表达随着一系列组织特异性启动子（promoter）的发现和应用，导入的外源基因逐步实现了在特定组织细胞内的表达。这样就使得对转入的外源基因功能的研究精确到了组织特异性表达的水平.转基因的组织特异性表达问题：表达时间能否控制？遗传工程动物制作的基本原理和技术•对遗传物质（DNA）的体外施工•主要建立在基因水平上，因此也被称为基因工程/重组DNA技术•相比于传统保种、育种技术的优势：1、高度预见性2、精确3、高效率4、打破自然界限制（时空、种属）基因工程动物•原理：分子遗传学•技术手段：分子生物学、微生物学•基本过程：体外构建杂交DNA(重组），导入活细胞，发育为个体•结果：改变原有遗传性状，获得新品种/物种•意义：使基因操作走向整体动物水平——从分子水平改造动物/改变动物基因组，从整体水平（活体动物）观察效应基因工程动物•基因工程动物：通过基因工程技术/重组DNA，人为改变遗传性状的动物•转基因动物：以实验方法将特定外源基因导入动物受精卵或胚胎，使之稳定整合于染色体基因组，并能够遗传给后代的一类动物（有别于嵌合体动物）1、其所有细胞均整合有外源基因2、其外源基因能够遗传给子代嵌合体•嵌合体在希腊神话中是指具有狮头、羊身和蛇尾的一种怪物。种内嵌合体1965年获得了小鼠的嵌合体后代1968年获得了绵羊的嵌合体后代1974年获得了大鼠、家兔的嵌合体后代1984年获得了牛的嵌合体后代1987年获得了猪的嵌合体后代种间嵌合体1973年小鼠与大鼠1980年家养小鼠与野生小鼠1983年牛与水牛1984年绵羊与山羊嵌合体•哺乳动物嵌合体的生产方法1．卵裂球聚合法将不同遗传性能而发育阶段相同或相近的胚胎卵裂球聚合在一起获得嵌合体的方法，胚胎发育阶段在8细胞至桑椹胚阶段较为理想。2．囊胚注射法把一种或多种胚胎的卵裂球、内细胞团细胞或EC细胞、ES细胞直接注射到另一枚囊胚的腔隙中获得嵌合体的方法。嵌合体•嵌合体的生产效率低，种间嵌合体仅在少数动物上取得成功，远缘动物嵌合体仍存在很大障碍。•通过嵌合方式可能会得到经济价值或观赏价值更高的动物。•种间嵌合体技术也为拯救濒危动物提供一种方法。•特异性嵌合体技术若能使嵌入的细胞定向分化为嵌合体的某一组织或某一器官，有极高的医学价值（人心猪，真人耳鼠）。转基因动物•广义：对动物基因组的所有改动•狭义：以显微注射、反转录病毒介导、胚胎干细胞介导等方式转入基因，获得新功能——转基因动物•基因转移/基因打靶：以精确的基因替换技术获得新基因，knock-inknock-out第一节、转基因小鼠转基因技术•转基因（狭义）原理和局限1、细胞学原理：利用MII期卵母细胞无核膜、外源基因易导入特点2、胚胎学原理：利用雌雄原核融合之前雄原核易见特点3、分子生物学原理：随机整合•整合位点、表达效果的不可预期性早期胚胎-单细胞期受精卵受精卵能够分化出各种细胞、组织，形成一个完整的个体，所以把受精卵的分化潜能称为全能性。随着分化发育的进程，转基因会分布到各种组织细胞中去，包括生殖细胞，因此，转基因是可以遗传的。转基因技术•常用转基因技术手段1、显微注射将外源基因直接注射到受精卵原核内，迄今应用较为普遍和富有成就对DNA片段大小无限制无需载体，可获无载体片段的转入目的基因操作简单，周期短各种随机整合结果：位点、多拷贝可能不整合/游离体转基因技术2、电脉冲法•利用高压电短脉冲破坏细胞膜电位，造成细胞膜可逆性穿孔，以便外源DNA进入细胞•瞬时转染/游离体、稳定转染/整合•DNA用量大、细胞容易死亡转基因技术3、逆转录病毒法•利用逆转录病毒侵入宿主细胞并整合于DNA的能力，适合难以观察到雄原核的禽类受精卵•整合率较高•单拷贝单位点•可能得到嵌合体、逆转录病毒的潜在危害、可携带DNA长度有限转基因载体的构建启动子（promoter）拟表达基因编码序列(CDS)…….受精卵原核DNA显微注射受精卵获得显微注射受精卵体外培养代孕母鼠输卵管移植转基因后鉴定PCR、southern印迹与野生型小鼠交配RNA印迹、RT-PCR、westernblot等转基因小鼠（原核注射法）构建过程第一法雄原核显微注射法一、设计转基因载体一个完整的转基因构件应包括目的基因、启动子、加强子和标记基因或报告基因。转基因构件的设计上还要考虑原核载体序列的影响。1、转基因调控序列包括基因加强子和启动子。在启动子的选择上可以如下两个方面进行考虑：（1）如需要得到外源基因全身一致表达的转基因品系出可选择一个管家基因启动子。（2）与一致表达相对的就是组织特异性表达，组织特异性表达的启动子成分要复杂的多，将在后面的条件转基因中介绍。二、雄原核显微注射法•常用转基因技术手段1、显微注射将外源基因直接注射到受精卵原核内，迄今应用较为普遍和富有成就对DNA片段大小无限制无需载体，可获无载体片段的转入目的基因操作简单，周期短各种随机整合结果：位点、多拷贝可能不整合/游离体一、DNA显微注射技术©2003JohnWileyandSonsPublishers优点：1.可靠性高、重复性好2.对于小鼠来说，产生转基因动物的效率比较高3.导入DNA片段的大小和类型不受限制4.转基因在代与代之间传递的稳定性好1980PNAS77,7380-7384缺点：1.整合位点的随意性可能对转基因表达造成影响2.可能会出现不希望的插入突变3.装置和技术的花费大时间长1、注射前准备用于显微操作的供体和受体母鼠的处理程序（1）供体准备；（2）受体注射前准备，即见下图。三、显微注射转基因小鼠模型的建立（1）受体母鼠怀孕产仔。胚胎移植后20~21天受体母鼠产仔，正常情况下产仔数是移胚胎数的50%~80%。（2）断奶时子代鼠编号、剪下1cm左右的尾部组织，提取DNA作整合检测。整合检测的方法有PCR、Southern杂交、限制性内切酶检测，检测结果阴性淘汰，阳性则作为G0代小鼠用于繁殖。通过显微注射法建立转基因小鼠模型、获得10个G0代整合阳性小鼠是必须的。（3）向C57BL/6或其他背景品系回交，F1代小鼠整合检测阳性，则表示外源基因已稳定整合到转基因鼠的生殖系中，这个外源基因是可能遗传的。（4）背景品系的纯化采用基因导入法继续向C57BL/6或其背景品系回交，即可建成以C57BL/6为遗传背景或回交品系为背景的能稳定遗传的近交系。（5）胚胎冷冻保种自F1代起，每一代都应冷冻200枚以上胚胎，以防止繁殖过程中出现基因丢失、繁殖障碍或其他原因造成转基因品系断线。（6）基因表达研究自F1代以后要重点研究的基因的表达，小鼠形态、功能的变化，组织病理变化，最终建立医学动物模型。胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞，可被诱导分化为所有机体细胞类型；哺乳动物囊胚期内的细胞团分离出的尚未分化的胚胎细胞（囊胚期内层细胞），但不能发育为胎盘，不具有发育为完整个体的全能性•它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。•可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。第二法、胚胎干细胞技术胚胎干细胞介导•将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能。•要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有基因结构及功能没有影响或影响最小。•培育筛选无损囊胚植入代孕母体子宫发育为转基因动物，也可整合外源基因的ES细胞注入受体囊胚腔中发育为嵌合体，理想中的嵌合体小鼠C中，导入外源目的基因的ES细胞最好发育成卵巢或睾丸。•对ES细胞的操作和培养容易•将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能。•要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有基因结构及功能没有影响或影响最小。转基因技术2、电脉冲法•利用高压电短脉冲破坏细胞膜电位，造成细胞膜可逆性穿孔，以便外源DNA进入细胞•瞬时转染/游离体、稳定转染/整合•DNA用量大、细胞容易死亡转基因技术3、逆转录病毒法•利用逆转录病毒侵入宿主细胞并整合于DNA的能力，适合难以观察到雄原核的禽类受精卵•整合率较高•单拷贝单位点•可能得到嵌合体、逆转录病毒的潜在危害、可携带DNA长度有限转基因技术4、精子载体法利用受精作用避免人工方法导致原核损伤实践中成功率较低转基因技术基因定点突变（基因打靶）•利用DNA同源重组，即同源DNA之间相互配对并互换的自然现象（自然状况下可增加自身和后代遗传多样性促进生物进化）•构建打靶载体（目的基因上下游同源DNA），实现特定基因的剔除/导入基因打靶•定向改变生物活体遗传信息。•遗传定向修饰包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，转基因动物应用用转基因动物建立疾病动物模型•模型来源一般途径：1、理化生物造模手段诱发获得（诱发模型）2、传统定向培育或自发筛选获得（自发模型）•-效果不确切不稳定•-周期长•-各种技术上和伦理的限制转基因动物应用•转基因动物大量用于遗传病、传染病、肿瘤的研究，且以大鼠、小鼠和兔为主•遗传病：单基因遗传疾病、多基因遗传疾病（舞蹈症、人囊性纤维化）•传染病：突破病毒宿主的