遗传工程动物模型

第一节概述人们经过了长期不懈的努力，渴望揭开生命之谜，虽有进展，但谜仍然是谜。然而，随着2001年6月人类基因组草图公布，生命科学也随着进入到一个新的纪元－后基因组时代，即由结构基因组转向功能基因组的研究，大规模、系统地研究基因功能及其在生理和病理过程中的作用。因此，遗传工程动物模型是必不可少的研究工具。一、定义运用各种技术手段有目的地干预动物的遗传组成，导致动物新的性状的出现，并使其能有效地遗传下去，形成新的可供生命科学研究和其他目的所用的动物模型，这类动物可被称为遗传工程动物模型。二、技术手段显微注射转基因技术基因定位突变技术化学或放射诱变技术显微注射法胚胎干细胞法(embryonicstemcells，ES细胞)逆转录病毒感染法精子载体法细胞核移植ENU诱变三、基本方法第二节转基因动物Gordon等人首次成功地将含有HSV和SV40DNA片段的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源DNA顺序TGM。1982年Palmiter等运用此法得到的所谓“超级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等等大小动物。从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传、肿瘤学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的开发研究等。一、概念通过实验手段将外源遗传物质导入到动物生殖细胞中，并能稳定遗传，由此获得的动物称为转基因动物。遗传改变：外源DNA的插入使基因组中任何一个基因的结构发生改变；外源DNA的插入使染色体发生重排；导入可以持久存在的遗传实体。二、基本原理目的基因：显微注射受精卵或胚胎细胞整合植入输卵管外源基因：顺式作用元件结构基因报告基因(reportgene)融合基因显微注射法胚胎干细胞法(embryonicstemcells，ES细胞)逆转录病毒感染法精子载体法细胞核移植三、基本方法以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。目前应用较广泛，最早最经典的方法。（一）雄原核显微注射法1.程序准备假孕母鼠受精卵的准备基因导入胚胎移植对幼鼠的鉴定PMSG外源DNA大小基本不受限制（1～50kb）；导入过程直观；整合率高2.优点：设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性转基因沉默3.缺点：基因特异表达的研究发现基因的新功能发现新基因建立基因表达、调控的动物模型建立人类疾病的动物模型等4.应用（二）胚胎干细胞（ES）法ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。在ES细胞上的基因操作：可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。胚胎干细胞(ES细胞)•能在体外培养，保留发育的全能性外源目的基因打靶载体•Neo（新霉素）阳性筛选标志•HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)1.必备条件打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞：重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种2.基本程序InjectionofEScellsintoblastocysts外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。3.优点ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。4.缺点遗传病研究肿瘤的研究生物制药5.在医学中的应用（三）反转录病毒法（四）精子载体法细胞核移植法转基因动物是在单细胞基因转染技术的基础上发展起来的。而许多基因的表达是无法通过转染的方法来研究；基因表达有时空与组织的特异性；外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；因此，只有通过转基因的动物才有可能研究基因的表达、调控及基因之间的相互作用。四转基因动物的意义进行功能基因组学的研究，研究外源基因在动物整体水平的表现调控规律。转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究。也可改变动物基因使其表现型更适合人类需要。还可以用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物质。第三节ENU诱变小鼠ENU致突变技术是高通量大规模筛选新基因及发育突变技术的化学方法：当人们还不能获得ES细胞时，小鼠遗传学家最常用的方法是用乙烷基亚硝基脲（ENU)处理公鼠，然后在后代中筛选显性或隐性突变的小鼠。随着越来越多的基因和微卫星标记被定位，突变基因的定位也随之变得容易；因此对小鼠进行化学诱变将越来越变得低成本而高效益。一、ENU诱变的技术路线1.ENU诱变的简单流程ENU处理雄性C57BL/6小鼠，10周后与同品系母鼠配种，Fl离乳时筛查，阳性突变小鼠留种，与同品系正常母鼠配种，Fl有亲代突变表型者留种(为显性遗传)，基因定位、培育新的模型、基因克隆、基因功能研究。隐性突变筛选需由Fl互交或F2回交Fl，发现突变表型者留种，进行进一步的研究。2．显性突变的筛选10周龄的雄性小鼠按150mg/kg体重的剂量腹腔注射ENU，60天后待处理公鼠恢复生殖能力后与野生型雌性配种，通过对F1代小鼠进行形态学、行为学、血液学、生理生化等指标的检测，可筛选基因的显性突变。3．隐性突变的筛选基因隐性突变的筛选需将F1代的雄性鼠与野生型雌性小鼠交配，再将F1代雌性小鼠与F1代雄性鼠回交或F2代雌、雄鼠交配，获得F3代小鼠，并将F3代小鼠用于大规模筛选。4．基因驱动法与表型驱动法相结合的ENU诱变筛选单基因剔除是典型的基因驱动的研究。研究者必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，绘制相应的物理图谱，构建特异性的打靶载体以及筛选中靶ES细胞等。通常一个基因剔除纯合子小鼠的获得需要1年或更长的时间。面对人类基因组计划产生出来的巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因剔除方法显得力不从心，不符合现代生物学高通量、大规模筛选的要求。用放射线导致缺失和突变以及用各种化学诱变剂诱导点突变等许多经典的遗传学研究属于表型驱动的研究。早在20世纪90年代初，研究者就提出带有第7号染色体缺失的小鼠可用来筛选ENU诱导的缺失区域内的点突变。基因打靶的研究进展使得研制携带染色体组任意片段的缺失、倒位或者易位突变小鼠成为可能。RamirezSolis应用位点特异的重组酶系统首次在小鼠ES细胞中实现了最长3～4cM染色体组片段的缺失、倒位和重复。并采用同源重组技术构建了大片段染色体缺失的基因剔除小鼠。将基因打靶这种基因驱动的研究和ENU诱变这种表型驱动的研究结合起来具有明显的优势。ENU诱变可以在短时间内产生大量的突变体小鼠，但点突变的鉴定依然是费时费力的工作。采用通过基因打靶获得的特定染色体组缺失或者易位的ES细胞建立突变小鼠可以简化筛选的程序和工作量，并把点突变限定在序列已知的区域内，这样可以大大简化点突变鉴定的过程。5．ENU突变表型筛选ENU诱导突变表型的筛选包括形态异常表型、行为和神经功能异常、血液学和临床生化指标和老年症状筛选等。形态异常表型的筛选通常在小鼠分窝时进行。行为和神经功能异常筛选包括肌肉缺陷和运动神经元低下、感官缺陷、精神、小脑平衡、自律行为方面的缺陷等。有表型的小鼠将通过更复杂的测试，如探险运动、食物摄取、学习和记忆；焦虑、神经心理学测试等等。血液学测试在小鼠6～10周时进行。随机挑选无表型的小鼠饲养1年以上再进行老年症状表型筛选。主要观察是否具有老年相关疾病的表型，包括体重增加、动脉硬化、骨质疏松、心血管异常、感知功能和行为异常等等。ENU诱变的最终目的是为了鉴定导致表型的突变基因，发现新的基因和新的代谢途径，促进人类对哺乳类动物基因功能的了解。位置候选基因法是鉴定突变基因的首选方法：用50只突变回交小鼠做连锁分析。突变大致可定位在10～20cM的范围内。分析500只回交小鼠可将突变定位在1cM的范围内。基因驱动法与表型驱动法相结合的ENU诱变筛选的小鼠，其突变已被定位在特定的染色体组区域内，因而不用再作连锁分析。二、ENU诱导点突变的鉴定在突变基因被精确地定位后，结合突变小鼠的表型进行候选基因的预测。候选基因的线索可从多方面的分析获得。比如小鼠表型是否与某种已知突变基因的人类疾病相似；小鼠的表型与候选范围内某些基因的表达模式具有相关性；候选范围内某些基因的功能与小鼠表型可能相关等。小鼠基因组已定位近7000多个微卫星，使得染色体上大约每0.35cM便有一个标记。可以根据已知微卫星的位置定位突变基因，相信随着技术的进步，稳定的高通量基因型鉴定方法将会极大地发展。