各种表达载体

表达载体一、原核细胞表达载体1.pBAD载体:特点;该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的PBAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。请注意:1.当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1EcoR1BamH1Kpn1和Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。同时记住，如在不含任何信号肽的PBAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N-末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。2在使用含OmpA分泌信号肽的PBAD表达质粒时，请应用OmpA分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。本公司目前有含OmpA分泌信号肽和不含任何信号肽的二种PBAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下:(a)、含OmpA分泌信号肽的PBAD表达质粒多克隆区域SDPBAD….TACCCGTTTTTTTCC….GCTAGCAGGAGGAAACGATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTAMAELTTCGCTACCGTAGCCATGGCCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNco1Sac1Kpn1Smal1BamH1Pst1Hind111(b)、不含分泌信号肽的PBAD表达质粒多克隆区域EcoR1Kpn1BamH1Pst1PBAD….TACCCGTTTTTTTGG….GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNde1Sac1Smal1Hind111下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞Origami(DE3)内高效表达2.pCAl-n&pCAl-pelB载体特点:该原核细胞表达载体是来源于以T7RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。因此，该表达载体在E.coliBL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主菌中能高水平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和凝血酶切点，故该蛋白产物易于纯化和产业化。此外，本公司利用分泌信号肽PelB，构建成新型的的原核细胞表达载体Pcal-PelB。此载体表达的蛋白产物能在分泌肽PelB的指引下进入细胞周质。(a).Pcal-nMKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGALLVPCATATGAAGGGACGATGGAAAAAACAATTTCATAGCCGTCTCAGCAGCCAACCCGCTTTAAGAAAATCTCATCCTCCGGGGCACTTCTGGTTCCNde1RGSPGILDSMGRLELKLRSAGCGTGGATCCCCGGGAATTCTAGACTCCATGGGTCGACTCGAGCTCAAGCTTAGATCCGCCBamH1Sma1EcoR1Nco1Sal1Xho1Sac1Hnd111(b).Pcal-PelB:Nde1actggagactcatATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGGGCMKYLLPTAAAGLLLLAAQPNco1Msc1BamH1EcoR1Sal1GCCATGGCCaaggatcctaagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtctagagccccgacgcgctgggAMA******3.pPOW3.0表达载体特点:该原核表达质粒含有噬菌体的重叠λPRPL热诱导启动子和编码热敏感抑制子的C1857基因，可使宿主细胞在合成蛋白前获得高密度的宿主细菌，进行高水平目的蛋白表达，并对蛋白合成提供紧密控制。PelB分泌信号肽能指引合成的外源蛋白通过胞浆膜进入胞质。特别提示:在进行重组质粒时，最好在N-未端用Nco1或Msc1位点，C-末端则可用BamH1、EcoR1位点进行拼接。图示为启动子、PelB分泌信号肽和多克隆位点区域Xho1λPRPL启动子ggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggcgcctcgagtaatttaccaacactactacgttttaactgaaacaaRBSNde1actggagactcatATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGMKYLLPTAAAGLLLLANco1Msc1BamH1EcoR1Sal1GCCCAGGGCGCCATGGCCaaggatcctaagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtctagagcccAQPAMA******说明:RBS为核糖体结合位点;*为终止密码子二、真核细胞表达载体1.pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。扦入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。2.pEGFP,增强型绦色荧光蛋白表达载体(EnhancedFluorecentProteinVector)特点:pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUCorigin能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。用途:该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。Excitationmaximum=488nm;Emissionmaximum=507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccgctagcgctaccggtcgccaccatg-.EGFP…BamH1…SV40polyA+Nhe1Age13.pEGFT-Actin,增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUCorigin能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。用途:pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。Excitationmaximum=488nm;Emissionmaximum=507图示为启动子和多克隆位点区域：pCMV….Nhe1….Age1….EGFP…Bgl11…Actin…BamH1…SV40polyA+4.pSV2表达载体特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。图示为启动子和多克隆位点区域：Pvu11…pSV40….Hind111….SV40IVS….SV40polyA+5．CMV4表达载体特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。图示为启动子和多克隆位点区域：CMVp…Bgl11…Kpn1…Mlu1…Cla1…Hind111…Xbal1…Sma1…GH…….SV40ori其他常用克隆Vector：pBluscriptIIKSDNA15ugpUC18DNA25ugpUC19DNA25ug保存液:TEBufferTEBuffer组成:10mMTris.HCL(Ph8.0)1mMEDTA产品说明:pBluescriptIIkS、pUC18&Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落，而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落，由此易于筛选有无外源DNA片段的载体。此外，这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序。用途:•克隆外源DNA片断.•进行基因表达.•使用M13、T7和T3引物进行测序.