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第一部分工具酶与基因工程一．限制性核酸内切酶1．限制性核酸内切酶的发现2．I类和III类限制和修饰酶的基本特征3．II类限制和修饰酶的基本特征4．甲基化酶的基本特征二．其它工具酶1．DNA连接酶2．聚合酶3．末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)4.SI核酸酶5．Bal31核酸酶6．碱性磷酸单脂酶限制性内切酶(RestrictionEndonuclease)*存在于任何一种原核细菌中.*在特异位点上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性片段.*各种生物呈现特征性的限制性内切酶切图谱.*在生物分类,基因定位,基因重组,疾病诊断,刑事侦察领域极为重要.一．限制性内切酶的发现：(宿主细胞的限制和修饰作用)宿主细胞的限制和修饰作用：两种不同来源的入-噬菌体入K；入B，能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（K株，B株）。当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。一但入K噬菌体在B株成功，由B株繁殖出入K后代，能感染B株,不能感染原来K株.1宿主细胞的限制和修饰作用；1．两种不同来源的入-噬菌体（入-K，入-B）。2．能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（K株，B株）。3．当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，（入K-B，入B-K）感染下降数千倍。4．一但入K噬菌体在B株成功，由B株繁殖出入-K后代，能感染B株,不能再感染原来K株.称为：宿主细胞的限制和修饰作用二．限制和修饰作用的分子机制1．大肠杆菌宿主细胞K株，B株，有各自的限制和修饰系统。1）它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点）3）hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。4）hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞K株，B株中，1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护.2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。------（修饰）3．当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解----------（限制）4.由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。5．但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记(一但入-K噬菌体在B株成功，由B株繁殖出入-K后代，能感染B株,不能感染原来K株.)6．细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外来DNA。C株不能产生限制性内切酶，其它来源入-噬菌体可以感染C株，而在C株繁殖入-噬菌体则在K株和B株受到严格的限制作用三．限制性内切酶的分类：（三大类）I．I类，II类,III类.2．I类，III类为限制---修饰酶。限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能单位包含在同一酶分子中。3．II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点专一，适合于DNA重组。四．原核细胞中限制和修饰系统四．原核细胞中限制和修饰系统I类酶II类酶III类酶酶分子三亚基双功能内切酶与甲基化酶分离二亚基双能识别位点二分非对称序列4-6bp序列，回文结构5-7bp非对称序列切割位点距识别位点1000bp在识别位点中或靠识别位点在识别位点下游24-26bp限制性反应互斥分开反应同时竟争与甲基化反应限制作用需要ATP需要需要不需要五．I类酶，III类酶限制-修饰酶基本特怔1）I类酶，EcoK，EcoB。（1）异源多聚体，亚基R.M.S分别具有限制,修饰酶的作用，特异性位点识别活性。（2）I类酶与DNA识别位点结合依赖亚基M与辅助因子S—腺苷甲硫氨酸(SAM)相互作用。（3）S—腺苷甲硫氨酸(SAM)通过变构作用使酶处于活性状态，酶与DNA识别位点结合后，根据甲基化状态发挥相应酶的活性，或限制,或限修饰，或不限制不限修饰2）III类限制修饰酶基本特怔（1）亚基R，MS亚基组成。MS亚基具有识别和甲基化修饰双重作用.（2）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。（3）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关MboII识别5’-AAGA-3’切割位点5’-GAAGANNNNNNNN/N-3’3’-CTTCTNNNNNNN/NN-5’3）II类限制修饰酶基本特怔（1）命名规则：生物体属名的第一大写字母和种名前两个小写构成基本名称基本名称+菌株名的字母+罗马字母（发现顺序）HidIIIHaemophilusinfuenzaed株中的第三个酶EcoRI基因位于Escherichiacoli抗药性R质粒上EcoRI细菌属名细菌种名种菌株类型有几种限制酶（2）特点A．识别序列–4，5或6个碱基对，EcoRI识别5’-G/AATTC-3’序列3’-CTTAA/G-5’B．180度旋转对称回文结构，对称轴在第三，四碱基之间。C．任何一个DNA分子，每9对碱基出现一个II类酶切口。（3）切割方式A．以酶切特点来分同位酶：识别相同序列切点不同。同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。粘性末端：（CohesiveEnds）两个突出末端可退火互补——DNA是分子重组的基础限制内切酶切出的三种断口六．甲基化酶的基本特征：1)Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，a)限制性内切酶，甲基化酶的识别位点相同，序列内使碱基甲基化，封闭酶切口。b)甲基化酶封闭一个限制性内切酶切口同时产生另一种酶切口。c)DNA腺嘌呤甲基化酶DarnDNA胞嘧啶甲基化酶Dcm七．酶切图谱示意图1。一圈表示一种酶。2．单切口酶在里圈，越多切口酶越在外面。3．大写英文字母表示片段（A，B，C…AB）。4．两种片段同样大小（A1A2A3…E1E2E3…）。几次实验后，大小不一致以虚线表示不肯定。八．DNA切接反应的影响因素1．限制性内切酶的切割反应10-50mmol/LTris-HCl(PH7.5),10mmol/LMgCl2,1mmol/LDTT(二硫苏糖醇)只是盐浓度不同，分低盐，中盐，高盐组,1）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度相同，可同时反应。2）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别不大，中，高盐，可同时反应。利于酶较贵重的盐浓度缓冲液。3）两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别大，低，高盐，不可同时反应。a)低盐组先切，加热灭活后，补加盐浓度再切。b)沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液c）两种酶不能同时反应，有先有后。图3-162．酶量标准反应37度反应1小时完全水解1微克所需的酶量。0.1—1.0微克DNA5微升10倍缓冲液2微升酶1微升（10倍过量）无菌水12微升总体积20微升酶加入量不超过总体积十分之一.九．酶切位点的确定lineDNAW=N+1cccDNAW=N1.片段大小2450lineDNAW=N+1cccDNAW=N2.两单酶切成三个片段,说明各有两个切点------p-------p---------75050012003.Pst1,1200,750不见,说明:(1)另外两个酶的切点在其中---x-----p------p---x------Xbo1500(2)两个Pst1酶的切点相距500500---1200---4.1200---300+900(被Xbo1)---x-----p------p---x-----300900Pst1距Xbo1为300--750----5.750—150+600----x------p-----p---x-----150600Pst1距Xbo1为600-------1400-------6.1400—600+500+300---x------p------p---x-----600500300-------------2450-------------7.2450-150+600+500+300+900---x------p------p----x-----150600500300900基因重组的其它工具酶1．DNA连接酶催化的基本反应形式：图3-11DNA双链分子上相邻3’羟基和5’磷酸集团共价结合，形成3’-5’磷酸二酯键，使原来断开的缺口重新连接起来。（1）T4DNA连接酶由T4噬菌体基因编码，分子量60KD。基本活性:图3-121）修复双链DNA上单链缺口2）连接RNA-DNA杂交双链上DNA链缺口3）连接完全断开两个平头双链DNA分子。修复双链DNA上单链缺口，连接RNA-DNA杂交双链上DNA链缺口，连接完全断开两个平头双链DNA分子。2．聚合酶DNA聚合酶活性3-131）5’---3’聚合酶活性2）3’---5’外切酶活性3）5’---3’外切酶活性4）核酸内切酶活性Klenow酶1）5’---3’聚合酶活性2）3’---5’外切酶活性作用：1）修复限制性内切酶造成3凹端，成为平末端。2）用同位素对DNA标记。3）催化第二链合成4）测定DNA序列3．末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)图3-141）适合于带有3’游离羟基的双链分子。2)DNA双链3’端突出时，TdT将脱氧核苷酸聚合在二条链的3’端。作用：TdT在人工粘性末端的构建极为有用。4.SI核酸酶1）降解单链DNA或RNA2）反应方式为外切和内切3）酶量大时降解双链核酸作用：切平突出单链末端,和发卡结构中环状。制作SI图谱5．Bal31核酸酶图3-151）3’端外切酶活性2）5’端外切和内切活性。作用：1）从双链DNA两端连续降解2）单链DNA外切和内切3）超螺旋结构的线性化4）在分子克隆中可控制性截短DNA分子6．碱性磷酸单脂酶BAP细菌的碱性磷酸单脂酶，CIP牛小肠的碱性磷酸单脂酶作用：1）催化核苷酸性5’端除磷反应。2）重组DNA中用于载体的5’末端除磷操作以提高重组效率。3）用于外源DNA片段5’端除磷防止外源片段之间连接。7．T4DNA聚合酶1）5’--3’聚合酶活性2）3’---5’外切酶活性3）5’---3’外切酶活性生成平头分子。作用：用于修平非平头以及由限制性内切酶水解产生3’突出末端。