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三文鱼原是西餐和日本料理的主要原料，不仅味道鲜美，而且富含有益心血管健康的奥米伽-3脂肪酸。三文鱼种类不少，在国内市场上最常见的是大西洋鲑，野生的大西洋鲑因为过度捕捞，已濒临灭绝，市场上卖的大西洋鲑99％以上是人工养殖的。大西洋鲑的生长速度缓慢，第一年体重只增加20～30克，一般要养三年才能上市。因此可以给大西洋鲑转入体型最大的三文鱼——大鳞大麻哈鱼的生长激素基因。转基因鱼剪切拼接导入表达（三）将重组DNA分子导入（四）目的基因的检测和表达转基因鱼的构建（一）获得大麻哈鱼生长激素基因目的基因（二）形成大西洋鲑受精卵受体细胞鱼类因其产卵量大且体外受精而成为研究转基因动物的最佳入选动物。（外源基因）运载体DNA+目的基因重组DNA分子把生物的遗传物质DNA分离出来，在生物体外，通过对DNA分子进行剪切、拼接，对生物的基因进行改造和重组，然后将重组的DNA（基因）导入适当的受体细胞内，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需的基因产物（蛋白质、多肽、酶等）。基因工程的概念其核心是构建重组DNA分子广义：把一种生物的基因转入另一种生物体中，使其产生我们需要的基因产物，或者让它获得新的遗传性状。（重组DNA技术）生物体外基因分子水平产生人类需要的基因产物基因重组操作环境：操作对象：操作水平：基本原理：工程结果：让目的基因在宿主细胞中稳定高效地表达操作目的：基本过程：剪切→拼接→导入→表达从此大西洋鲑的身上得到了世界上从没有过的基因？（不产生新基因，产生新物种吗？）经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术——基因工程。理论基础•DNA是遗传物质的发现•DNA双螺旋结构的确立•遗传信息传递方式(中心法则)的认定—使来自异种生物的DNA拼接成为可能——使基因在异种生物细胞内表达成为可能基因工程的诞生技术保障基因工程工具的发现和应用•限制性核酸内切酶•DNA连接酶•载体DNA工具酶思考：如何将大马哈鱼细胞内的生长素基因从它的DNA分子中切割下来？如何将切下来的生长素基因与运载体DNA连接起来？如何将重组的DNA运送到大西洋鲑细胞？需要切割DNA的工具（分子手术刀）需要连接DNA片断的工具（分子缝合针）需要基因转移的工具（分子运输车）——限制性核酸内切酶——DNA连接酶——基因载体工具酶最初从原核生物中分离，后来在酵母菌中也有发现(针对外来DNA，保护自身免受外源DNA入侵)4000种，常用200多种。1、来源：2、种类：3、作用：一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”（简称限制酶）对DNA特定的核苷酸序列进行识别和切割基因工程的基本工具能够识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。思考能否切割烟草花叶病毒上人们想要的目的基因？重播4、作用部位：磷酸二酯键专一性--识别特定的序列、有特定的切点5、作用特点：EcoRI识别GAATTC序列，并在G和A之间切开限制酶在切断DNA时，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，他们之间碱基正好互补配对，因此称这些片断为粘性末端。5′5′3′3′专一性--识别特定的序列、有特定的切点回文序列平末端：平切粘性末端：错切•作用结果：下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的是()A．一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B．限制性内切酶的活性受温度影响C．限制性内切酶能识别和切割RNAD．限制性内切酶可从原核生物中提取C假设某病毒的一段序列如下图所示，其中某部位可被限制性内切酶A识别并切割，则限制性内切酶A识别的序列为以下哪个？CGTCATCGATGATGCAGCTCGCAGTAGCTACTACGTCGAG(A)ATGATG(B)ATCGAT(C)TGCAGC(D)CAGCTC【答案：B】（多选）某DNA分子中含有某限制性核酸内切酶的一个识别序列，用该限制酶切割该DNA分子，可能形成的两个DNA片段是（）CD限制酶可辨识并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ及BglⅡ的辨识序列及每一种限制酶的特定切割部位。BamHⅠEcoRⅠHindⅢBglⅡ↓↓↓↓GGATCCGAATTCAAGCTTAGATCTCCTAGGCTTAAGTTCGAATCTAGA↑↑↑↑其中哪两种限制酶切割出来的DNA片段末端可以互补结合，其末端互补序列是?DNA5′3′3′5′外源基因GCATTGCAACGTCGTAGCATTGCA5′3′3′5′注意：一般情况下，在获得目的基因的过程中，用一种或两种的限制性内切酶来酶切。思考：要想获得某个特定性状的基因必须要用限制性核酸内切酶切几个切口？可产生几个黏性末端？切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端。如果让两者的黏性末端通过氢键连接起来，是否就可以形成重组的DNA分子了？基因工程的基本工具2、DNA连接酶（T4噬菌体、大肠杆菌）两条链的骨架部分，形成磷酸二酯键•连接部位：具有相同黏性末端的两个DNA片段连接起来，形成重组DNA分子。•结果：•限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键，只是一个是切开，一个是连接•注意：CGGCCGTTAAAATTGCTATA•氢键的断裂与形成与限制酶、DNA连接酶无关。专一性？CGGCCGTATAATATGCGCGCTAATCGTATAATATGCTATAEcoRIEcoRICGGCCGTTAAAATTGCGCGCTAATCGTTAAAATTGCTATACGGCCGTTAAAATTGCTATA用同一种限制酶来切割两种来源不同的DNA，会产生相同的黏性末端。思考：用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要形成几个磷酸二酯键？2个用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？4个外源基因（如生长激素基因）怎样才能运送到受体细胞（如大西洋鲑鱼细胞）？需要“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体基因工程的基本工具3、基因载体（运载体）作为运载工具，将外源基因送入受体细胞。•作用：•条件：⑶能在宿主细胞内自我复制并稳定地保存⑴有一个或多个限制酶切点，可使外源基因插入其中⑷具有某些遗传标记基因，以便进行筛选⑵对受体细胞无害质粒（最常用）、噬菌体和某些动植物病毒•种类：启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因载体扩增思考：假如外源基因导入受体细胞后不能复制会怎样？作为载体如果没有限制酶切割位点将怎样？外源基因是否进入受体细胞，你如何去察觉？如果载体对受体细胞有害将怎样？会在细胞增殖中丢失外源的基因不可能插入如果载体上有遗传标记基因，就可通过标记基因的表达来检测。将影响受体细胞新陈代谢，进而使转入的外源基因也可能无法表达。质粒细菌及酵母菌等。最常用的是大肠杆菌的质粒。•来源：•本质：•特点：染色体外的小型双链环状DNA分子。•能自我复制；•常具有抗生素抗性基因(标记基因)；•其存在对宿主细胞无影响。可以检测质粒是否导入了受体细胞思考：质粒上存在的标记基因有什么用途？要想将某个特定基因与质粒相连，需要用几种限制性核酸内切酶处理？同1种或同两种练习：1、科学家们经过多年努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程，实施该工程的最终目的是A.定向提取生物体的DNA分子B.定向地对DNA分子进行“剪切”C.在生物体外对DNA分子进行改造D.定向地改造生物的遗传性状【答案：D】2、以下说法正确的是A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来【答案：C】练习：4、基因工程又叫重组DNA技术。假设以大肠杆菌质粒作为基因载体，并以同一种限制性核酸内切酶切割载体与目的基因，将切割后的载体与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶。连接产物至少有种环状DNA分子(假设两两结合)，它们分别是：3运载体与运载体相连、目的基因与目的基因相连、运载体与目的基因相连3、人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性B.有利于对目的基因是否导入受体细胞进行检测C.增加质粒分子的分子量D.便于与外源基因连接【答案：B】5、下图是将人的生长激素基因导入B细胞内制造“工程菌”示意图，所用载体为质粒A。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导入细菌B后，其上的基因能得到表达。请回答下列问题：(1)若把通过鉴定证明导入了普通质粒A或重组质粒的细菌放在含有氨苄青霉素的培养基上培养，会发生的现象是：其原理是：(2)导入B细胞中的目的基因成功表达的标志是：有的能生长,有的不能生长普通质粒含氨苄青霉素基因；重组质粒氨苄青霉素基因被破坏。能合成人的生长激素限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？能。因为由两种限制性切割后所形成的粘性末端是相同的。练习1、下图表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，判断正误A．a通常存在于细菌体内，目前尚未发现真核生物体内有类似的结构B．b识别特定的核苷酸序列，并将A与T之间的氢键切开C．c连接双链间的A和T，使黏性末端处碱基互补配对×××抗生素抗性基因SmaIBamHIHindIIIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIHindIIISmaI目的基因质粒1.图中的质粒和外源DNA构建重组质粒,能不能使用SmaI切割?为什么?2.若将图中的目的基因插入载体,需要用哪一种限制酶同时切割载体和目的基因?3.与只使用EcoRI相比较,使用BamHI和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？AATTCG…………GCTTAA用两种限制酶防止目的基因与载体的自身环化。GATCCG…………ATTCGA1、只使用EcoRI2、使用BamHI和HindⅢGCTTAAAATTCG载体AATTCG…………GCTTAA目的基因ATCTAG5533…………目的基因GATCTA5AATTCGCTTAAG335使用两种限制酶，防止载体与目的基因反向连接有关DNA酶将两个DNA片段通过磷酸二酯键连接。•DNA水解酶：•DNA解旋酶：•限制性核酸内切酶：•DNA聚合酶：•DNA连接酶：将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解时生成磷酸、脱氧核糖和含氮碱基。使DNA解旋成单链，作用部位是碱基与碱基之间的氢键。（在适当的高温、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋）以一条DNA链为模板，将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接成互补DNA链。将DNA切成片断，作用部位是磷酸二酯键。转基因鱼的优良经济性状为水产业提供了巨大的发展潜力,但转基因鱼释放到自然环境后的生态效应则引起了很多争议。人们对转基因鱼的一些观点Q1:有人担心吃转基因鱼会引起过敏？Q2:转基因鱼逃到野外，与野生鱼交配，会把野生鱼的基因给“污染”了？Q3:转基因鱼在野外与野生鱼争夺食物和配偶，有可能导致野生鱼灭绝？Q4:养殖转基因鱼对环境的正面的影响？基因工程的诞生时间：•1972年，斯坦福大学合成第一个人工DNA重组产物•1973年，斯坦福大学实现了细菌之间的性状转移——标志基因工程的诞生20世纪70年代•不同生物的DNA能拼接在一起基因工程的成功能说明哪些问题？说明所有生物的DNA都具有相同的化学组成(四种脱氧核苷酸)和空间结