多基因共表达载体的构建策略

多基因共表达载体的构建策略曹慧青，丁金凤国外医学（分子生物学分册）2002Vol.24No.1多基因共表达载体的应用表达异源多聚体蛋白的亚单位，如免疫球蛋白、细胞受体、白细胞介素、转录因子等同时表达针对同一靶细胞的几种异源蛋白以取得联合或协同的作用，如原癌基因、抗血管生成基因、自杀基因等。策略一：多启动子表达载体原理：带有各自独立启动子的多个表达盒构建于一个载体上，转录出多种不同的mRNA，并翻译出不同的蛋白。优点：简便缺点：①内部启动子占据载体上有限的克隆空间②启动子间相互干扰，造成不同基因的表达水平不一致策略二：剪切载体原理：利用一个启动子，在外源基因两侧提供剪切供体/受体位点，通过剪切初始转录本，形成不同的mRNA，分别表达两个基因缺点：可变剪切机制未明，双基因表达效率很不稳定策略三：表达融合基因原理：两基因用linker（多选择中性疏水氨基酸）或直接相连，使用同一开放阅读框，翻译产生嵌合的一个双功能融合蛋白分子优点：翻译水平等量表达，常用于阳性/阴性双选择标记载体、筛选标记/报告基因载体的构建缺点：①可能由于构像的改变使其中一个或两个基因的功能受到影响②若两基因产物有不同的细胞定位，也会影响基因的正常功能。也就是说表达平衡，而功能并不平衡策略四：基因之间以IRES序列连接原理：内部核糖体进入位点（IRES）序列来源于某些病毒和细胞的mRNA5‘端的一段非翻译区。在上游启动子的控制下，该序列及与之相连的基因可同时转录，并以不依赖帽的方式启动远端mRNA的翻译，从而在同一转录本上翻译出不同的蛋白优点：①克服了双启动子之间相互抑制的现象②简化了传统的双启动子表达盒模式繁琐的阳性克隆筛选过程③可以拓展到构建双IRES序列三表达基因载体不足：转录等量，翻译独立。以IRES启动的翻译效率较帽依赖的翻译效率低。置于IRES下游外源基因的表达量是其上游帽启动翻译基因的20%-50%。不同来源的IRES序列组成不同，长度各异，在不同细胞类型中的作用也各异来源于闹心肌炎病毒EMCV的该序列又称为不依赖帽的翻译增强子，在大部分细胞中可直接招募核糖体起始其下游顺反子的翻译。但对其实密码的位置要求严格，只有该序列中的第11个可作为起始密码。来源于脊髓灰质炎或口蹄疫病毒的IRES序列对其后的任一个符合KOZAK序列的AUG均可有效的起始翻译，因而得到更为广泛的应用。IRES序列置于两个顺反子之间时，它与第一个顺反子的终止密码的最佳距离为80bp。少于40或多于300-400bp会大大的降低IRES序列的翻译效率。策略五：基因之间以Furin的切割靶点序列连接原理：Furin是一种广泛存在的胞内蛋白酶，定位于高尔基复合体，在真核生物高度保守，可识别各种分泌型蛋白前体的精-X-精/赖-精氨酸共有序列并在此位点对其进行切割。利用这一点，将编码切割位点的连接子置于分泌蛋白或膜结合蛋白的cDNA序列间，转录时可以得到一条单顺反子，翻译成嵌合的融合蛋白，在加工过程中Furin切割成各个分离的蛋白产物，进而进行分泌性表达。特点：可以多基因表达。表达蛋白的摩尔比由载体上的编码序列数决定细胞选择性：COS细胞中Furin含量少，融合基因的各蛋白表达量低;CHO细胞中，精-X-赖-精介导的切割效率为50%，而精-X-精-精只有30%。策略六：基因之间以2A序列连接原理：2A是一种具有自我加工能力的蛋白酶，在不同病毒中它的长度、作用位点各不相同。在口蹄疫病毒中的2A序列有长短两种类型，长型有201bp，编码39个氨基酸，短型有96bp，编码17个氨基酸。两者作用相似，均可独立的用于构建多基因载体。将两基因分别克隆到2A序列的两侧，去除上游基因的终止密码形成单一的开放阅读框，翻译出的多聚蛋白可在编码2A区域的C末端被切割为两个蛋白，上游蛋白融合了2A的C端多肽，并释放出完整的下游蛋白。2A与Furin的不同之处：①2A的切割位点在自身C端最末位的两个氨基酸之间（甘-脯）②切割作用伴随翻译过程完成③切割活性高达85%-99%但是具体的切割机制不明可用于与IRES序列一起构建多顺反子载体。研究表明两个近邻的IRES序列会降低基因的表达。因此，2A序列在构建多顺反子时是IRES序列的有益补充。