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双水相萃取技术(aqueoustwo-phaseextraction)主要内容：一、双水相萃取的基本理论二、双水相萃取工艺流程操作三、影响双水相的因素四、双水相萃取的应用五、双水相萃取技术的发展•双水相萃取现象最早是1896年由Beijerinck在琼脂与可溶性淀粉或明胶混合时发现的，这种现象被称为聚合物的“不相溶性”(incompatibility)。•20世纪60年代瑞典Lund大学的AlbertssonPA及其同事们最先提出双水相萃取技术并做了大量的工作。•70年代中期西德的KulaMR和KronerKH等人首先将双水相系统应用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，大大改善了胞内酶的提取效果。前言一、双水相萃取的基本理论1、双水相体系的组成2、双水相萃取的特点3、双水相萃取原理1、双水相体系的组成双水相体系的主要成因——聚合物的不相溶性双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的分子空间阻碍作用，无法相互渗透，当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两相，因为使用的溶剂是水，所以称为双水相。①聚合物∕聚合物双水相当2种聚合物混合时，由于2种聚合物间存在较强的斥力或空间阻碍，使2者无法相互渗透，不能形成均一相，故达到平衡后形成两相，这2种聚合物分别位于互不相溶的两相中，即形成聚合物/聚合物双水相体系。聚合物双水相形成机理两种聚合物相互混合混合体系熵的增加两个因素分子间作用力分离（聚合物的不相容性）分相富含不同聚合物的两相形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypropyleneglycol)/聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。②聚合物∕无机盐双水相某些聚合物溶液和一些无机盐溶液相混时，在一定浓度下，由于盐析作用，也会形成两相，即聚合物/无机盐双水相体系，常用的无机盐有磷酸盐和硫酸盐。除高聚物、无机盐外，能形成双水相体系的物质还有高分子电解质、低分子量化合物。各种类型的双水相体系类型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非离子型聚合物/非离子型聚合物聚乙二醇葡聚糖聚乙烯醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮高分子电解质/非离子型聚合物羧甲基纤维素钠聚乙二醇高分子电解质/高分子电解质葡聚糖硫酸钠羧甲基纤维素钠聚合物/低分子量化合物葡聚糖丙醇聚合物/无机盐聚乙二醇磷酸钾硫酸铵双水相的形成在聚合物∕盐或聚合物∕聚合物系统混合时，会出现两个不相混溶的水相PEG=聚乙二醇(polyethyleneglycol)Kpi=磷酸钾DX=葡聚糖(dextran)2、双水相体系的特点优点：•操作条件温和，在常温常压下进行。•两相的界面张力小，一般在10-4N/cm量级，两相易分散。•两相的相比随操作条件而变化。•易于连续操作，处理量大，适合工业应用。•两相的溶剂都是水，上相和下相的含水量高达70%～90%，不存在有机溶剂残留问题。缺点：•成相聚合物的成本较高，且高聚物回收困难。•水溶性高聚物大多数粘度较大，不易定量控制。•易乳化，相分离时间较长。•影响因素复杂。3、双水相萃取原理(1)分配系数双水相萃取与一般的水-有机物萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同,物质进入双水相体系后,由于分子间的范德华力、疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之间电荷的作用,目标物质在上、下相中的浓度不同,从而达到分离的目的。其分配规律服从Nernst分配定律，即K=Ct/Cb，其中Ct、Cb分别为上相和下相的浓度，K为分配系数。各种物质的分配系数K是不一样的，因而双水相体系对生物物质的分配具有很大的选择性。系统固定时,分配系数K为一常数,与溶质的浓度无关。当目标物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或更小的分配系数。(2)萃取率当某一物质A的水溶液,用有机溶剂萃取时,则萃取率E应该等于:有机相中被萃取物的量两相中被萃取物的量×100%E=萃取率反应了物质被萃取的完全程度。双水相萃取是一种可以利用较为简单的设备，并在温和条件下进行简单操作就可获得较高收率和纯度的新型分离技术。双水相体系中相关的计算公式为：R=Vt／Vb，K=Ct／Cb，G=1/RK，Y=（1+1／RK）-1×100％式中：R－相比；Vb－下相体积，mL；Vt－上相体积，mL；K－分配系数；Cb－下相溶质的质量浓度，g／mL；Ct－上相溶质的质量浓度，g／mL；G－上、下相溶质的质量比；Y－萃取率，％。(3)双水相相图制作以PEG4000∕硫酸铵双水相体系为例①建立PEG4000的吸光度-质量分数标准曲线②建立硫酸铵的电导率-质量分数标准曲线③建立PEG4000∕硫酸铵双水相相图约取5mL20%的PEG4000溶液溶于50mL的离心管里面,用100μL移液器逐滴加入40%的硫酸铵溶液,振荡混匀直至出现浑浊，将混合液放在离心机上离心5min,溶液分层后分别取其上、下相各1克稀释100倍,并测其电导率记录数据。再取溶液上下相的溶液各1克溶于100mL容量瓶中，测定其吸光度并记录数据。接着在混合液中加入一定量的去离子水至浑浊变澄清，再次逐滴加入硫酸铵溶液至出现浑浊且半分钟内浑浊不变化，重复上述步骤。根据测量数据作出PEG4000∕硫酸铵溶液的双水相相图。图中的曲线为双结线(Binodal)，双结线以下的区域为均相区，以上的区域为两相区，也称为工作区。连接双结线上两点的直线称为系线(Tie一line，简称TL)，表示了双水相体系达到相平衡时上、下相组成和总组成的关系。双水相体系的双结线模型系线上的各点上下相的组成相同，而体积不同，上下相的体积比近似服从杠杆原理，即：Vt/Vb=Ab/At其中，Vt/Vb分别为上相和下相体积，Ab/At分别为A点与B点和A点与T点之间的距离。双水相体系的双结线模型双水相体系的双结线模型系线长度通过下式计算：△代表上下相的浓度差。一般情况下，体系对被分配物质的处理能力与系线长度成正比。双水相体系的双结线模型系线越长，界面张力就越大，两相间的性质差别就越大，被分配物质在相间分配系数K亦越大;反之就越小。当系线长度趋向于零即接近于临界点(criticalpoini，简称Cp)时，两相差别消失，界面张力为零，体系成为均一的一相。a双节线系线b双节线均相区均相区两相区两相区系线临界点二、双水相萃取工艺流程操作工艺流程主要由三部分组成：•目标产物的萃取•聚合物（PEG)的循环•无机盐的循环双水相萃取工艺流程图上相萃取液PEG无机盐｝ATPE相似相溶原理相体系回收示意图PEG的循环在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。PEG回收有2种方法：一种即前面所述的加入盐使蛋白质转入富盐相来回收PEG，一种是将PEG通过离子交换树脂，洗脱剂先洗出PEG，再洗出蛋白质。现在常用的方法是将第1步萃取的PEG相或除去部分蛋白质的PEG相循环利用。无机盐的循环一种方法是将无机盐相冷却，如将含磷酸钠的盐相冷却到6℃，使盐结晶析出，然后用离心机分离收集；另一种是用电渗析法、膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。双水相萃取所用的设备一般都是其他两相体系如水和有机溶剂体系所通用的设备，有商业化的混合器和沉淀器系统以及离心分离机已成功应用于双水相萃取。尽管刚开始应用时，大多数双水相萃取是间歇式的，但此技术更适合于错流萃取的连续生产，这样可有效利用空间和时间，尤其是在与其他分离技术如凝胶过滤、膜分离等相结合使用时。1988年，Hustedt等人证明在工业生产规模上可将双水相体系用于连续错流萃取延胡索酸酶和青霉素配基转移酶。三、影响双水相萃取的因素影响双水相萃取平衡的主要因素有：组成双水相体系的高聚物类型、高聚物的平均分子量和分子量分布、高聚物的浓度、成相盐和非成相盐的种类、盐的离子浓度、pH值、温度等。1）聚合物的类型不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性，聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄糖硫酸盐糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚糖＜甲基纤维素＜聚乙二醇＜聚丙三醇，这种疏水性的差异对目的产物的作用是重要的。2）聚合物及其相对分子质量不同聚合物的水相系统，疏水性不同；同一聚合物，疏水性随分子量增加而增加，其大小的选择取决于萃取过程的目的和方法，在PEG/Dex体系中，PEG分子量的减少，会使萃取液在两相中的分配系数增大，当PEG的分子量增加时，在质量浓度不变的情况下，亲水性蛋白质不再向富含PEG相中聚集而转向另一相。Fig.1PEG200(400)-(NH4)2SO4相图(NH4)2SO4(%w/W)PEG（%w/w)0102030405060812162024283236PEG_400PEG200在双水相系统中，界面张力很低并且随双曲线长度呈指数规律的增大。当系统组成处于临界点时，系线长度为零，上下相组成相同，萃取液均匀地分配在两相中，分配系数K=1。当成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合物的总浓度增加时，系统远离临界点，系线长度增大，两相性质的差别也增大，同时萃取液在两相中界面张力的差别增大，使其趋于向一侧分配，即K值或增大超过1，或减小低于1。3）聚合物的浓度4）温度的影响温度的变化影响相物理性质的变化，例如粘度和密度等，从而影响萃取液的分配。但总的来说，温度对分配系数的影响是通过对相图的影响来间接达到的。在临界点附近，温度对相图的影响最显著，对分配系数的影响最强。当远离临界点时，温度对相图的影响较小，分配系数对温度的变化也不敏感。这是由于远离临界点时，成相聚合物的浓度增大，对萃取液的稳定作用增强。但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响很小，1-2度的温度改变不影响目标产物的萃取分离。大规模双水相萃取操作一般在室温下进行，不需冷却。这是基于以下原因：(l)常温下，溶液的粘度较低，容易分相(2)成相聚合物PEG对某些具有生物活性溶质如蛋白质有稳定的作用，常温下蛋白质一般不会发生失活、变性。(3)常温操作节省冷却费用。温度对双水相系统的影响体系pH值会影响溶液分子中可离解基团的离解度，从而改变分子表面的电荷数来影响分配。同时PH值还会影响缓冲离子如HPO42-、PO43-等的分配，以改变相间电位来达到改变分配系数的目的。另外在研究分配系数与pH值的关系时，若加入不同种类的中性盐，由于电位差的不同，其相应关系也不同。5）PH值的影响6）无机盐的浓度盐的正、负离子在两相间分配系数不同，两相间形成电位差，从而影响带电生物大分子的分配。无机盐浓度的不同能改变两相间的电位差。利用双水相萃取技术分离纯化时，其选择双水相体系的一般原则是:(l)目标产物在两相中有较大的分配系数(2)能保持具有生物活性溶质的活性(3)体系易于分相，可利用静止或者离心沉降法进行分相(4)降低操作成本，采用廉价的双水相体系来萃取分离综合利用以上因素，可通过实验确定最佳双水相萃取系统。以PEG/硫酸铵双水相体系萃取一种蛋白质为例：（1）固定硫酸铵为某一浓度，用梯度浓度的聚乙二椁与其形成一系列双水相体系，萃取分离蛋白质，分别测量上、下相蛋白质的含量，确定PEG的最佳浓度。（2）选取（1）中的最佳PEG浓度，在此浓度下与梯度浓度的硫酸铵形成双水相体系，进行蛋白质的萃取分离，测定上、下相中蛋白质的含量，确定出最佳的硫酸铵浓度。（3）在（1）和（2）的基础上，选用最佳的PEG浓度和硫酸铵浓度组成双水相体系，在蛋白质稳定的PH范围，用一系列不同PH值的缓冲液调节双水相体系的酸碱环境，测定上、下相中蛋白质的含量，确定出最佳的PH范围。（4）在最佳PEG浓度、硫酸铵浓度和PH值的基础上，用相同的方法得到最适宜的温度。四、双水相萃取的应用双水相萃取自发现以来，无论在理论上还是实践上都有很大的发展，在最近几年中更为突出，在若干生物工艺过程中得到