第五章-双水相萃取技术

第五章双水相萃取技术(AqueousTwoPhaseExtraction)•双水相萃取(aqueoustwo-phasepartitioning)是1896年Beijerinck把琼脂和可溶性淀粉或明胶相混合时最早发现的。1956年，瑞典伦德大学的Albertsson重新发现此体系并第一次用来提取生物物质。1979年，Kula和Kroner等人将双水相体系用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，使胞内酶的提取过程大为改善。此后，对于双水相体系的研究和应用逐步展开并取得很大进展。在提纯有生理活性的生物物质方面，与其他提取方法相比，它具有许多优势。现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化，并逐步向工业化生产迈进，展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方面的巨大应用前景。•双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两相。•因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两相中水分都占很大比例(85％~95％)，活性蛋白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固-液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取技术(又称水溶液两相分配技术)是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。一、双水相萃取的基本特性•2种天然的或合成的亲水性聚合物的水溶液相互混合时，最常见的现象是，由于2种聚合物间存在较强的斥力或空间阻碍，使2者无法相互渗透，不能形成均一相，故达到平衡后形成两相，这2种聚合物分别位于互不相溶的两相中，即形成聚合物/聚合物双水相体系。另外，某些聚合物溶液和一些无机盐溶液相混时，在一定浓度下，由于盐析作用，也会形成两相，即聚合物/无机盐双水相体系，常用的无机盐有磷酸盐和硫酸盐。除高聚物、无机盐外，能形成双水相体系的物质还有高分子电解质、低分子量化合物。•可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypropyleneglycol)/聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相富含无机盐。各种类型的双水相体系类型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非离子型聚合物/非离子型聚合物聚乙二醇葡聚糖聚乙烯醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮高分子电解质/非离子型聚合物羧甲基纤维素钠聚乙二醇高分子电解质/高分子电解质葡聚糖硫酸钠羧甲基纤维素钠聚合物/低分子量化合物葡聚糖丙醇聚合物/无机盐聚乙二醇磷酸钾硫酸铵•常用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(dextran)体系和PEG/磷酸盐体系。PEG/dextran体系一般用于小规模地分离生物大分子、膜、细胞等，PEG/无机盐体系主要用来大规模地提纯酶，这是因为PEG/无机盐体系的萃取专一性更高，葡聚糖价格昂贵的缘故。•物质在两相中的选择性分配是疏水键、氢键和离子键等相互作用的结果，可溶性物质的分配情况可由分配系数K来表征，细胞这些更大颗粒的分配情况则由分配比P来表征。影响蛋白质及细胞碎片在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH值、温度等。双水相萃取的基本特点•(1)体系有生物亲和性。两相中的水分含量通常高达65%～90%，所用的PEG、dextran等高聚物或磷酸盐、硫酸盐等无机盐对蛋白质、核酸等生物活性物质无毒害，甚至还有稳定保护作用，而且相界面张力比水-有机或有机-有机两相体系的界面张力要小1～3个数量级。由于生物活性物质在有机溶剂中易变性，再加上有的生物活性物质亲水性很强，不溶于有机溶剂，有机溶剂萃取等分离技术难以在生物活性物质的分离中发挥其效能。•(2)与常用的亲和层析相比，双水相萃取能够在较少的溶液量和较短的操作时间内获得较高产量的产品。另外，操作能够容易、精确地按比例放大，非常适合大规模应用，可进行连续生产。而亲和层析由于操作难于放大，应用受到限制。•(3)聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类和浓度、pH以及温度等均能影响被分配物质在两相间的分配，所以操作容易进行控制，进而达到目的产物的最佳萃取条件。•(4)可与细胞破碎相结合，即细胞悬浮液中加入PEG和无机盐后再通入珠磨机进行破碎，然后用离心机分相。既节省了萃取设备和时间，又避免了胞内酶的损失。•(5)能进行萃取性的生物转化。在一些双水相体系中可将发酵生产过程中的生物转化与下游处理的第1步相结合，即生物反应在其中一相中进行，同时生成的反应产物被连续萃取到另一相中。不仅解决了产物反馈抑制作用造成的产量低的问题，而且酶在高聚物溶液中比在缓冲液中更稳定，活性更大。因为生物反应和生物产物的提取同时进行，尤其适于连续生产。•(6)亲和萃取(亲和分配)可大大提高分配系数和萃取专一性。由于目标蛋白质与其他杂蛋白的理化性质相近，造成其萃取专一性不高。亲和萃取就是将一种和目标蛋白质有很强亲和力的配基与一种成相聚合物共价结合，该成相聚合物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃取时，目标蛋白质专一性地进入结合有配基的那种成相聚合物所在相中，其它杂蛋白则进入另一相。此技术已用于乙醇脱氢酶、丙酮酸激酶和核酸内切酶等酶以及细胞、细胞器、膜等粒子的提取。双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是成本上都要优越得多。比传统的分离方法(如盐析或有机溶剂沉淀等)相有很大的优势，因此已被广泛地应用在生物化学、细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病毒等产品的分离纯化和分析等。用此法提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，如乙醇脱氢酶的分离已达到几十千克湿细胞规模，β-半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。双水相萃取的优点•操作条件温和，在常温常压下进行。•两相的界面张力小，一般在10-4N/cm量级，两相易分散。•两相的相比随操作条件而变化。•上下两相密度差小，一般在10g/L。因此两相分离较困难，目前这方面研究较多。•易于连续操作，处理量大，适合工业应用。二、双水相萃取的原理•依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂的相互作用：–氢键–电荷力–疏水作用–范德华力–构象效应聚合物的不相溶性(incompatibility)：当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。图a和b分别为PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图1双水相系统a双节线系线b双节线均相区均相区两相区两相区系线临界点在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，因此K点称为临界点(criticalpoint)。2双水相中的分配平衡与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系数也用m=c2/c1表示。为简便起见，用c1和c2分别表示平衡状态下下相和上相中溶质的总浓度。生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和:lnm=lnme+lnmh+lnmlme，mh，ml分别为静电作用、疏水作用和生物亲和作用对溶质分配系数的贡献。1）静电作用非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响，利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表达式：lnm=-Mλ/RTm-分配系数；M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和成相系统有关的常数;R-气体常数，J/(mo1．K)；T-绝对温度，K。因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之间呈线性关系，在同一个双水相系统中，若λ0，不同溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是因为式中的λ随双水相系统而异。实际的双水相系统中通常含有缓冲液和无机盐等电解质，当这些离子在两相中分配浓度不同时(即分配系数≠1)，将在两相间产生电位差，此时，荷电溶质的分配平衡将受相间电位的影响，从相平衡热力学理论推导溶质的分配系数表达式为:lnm=lnmo+ΔφFZ/RT因此，荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比,由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的相间电位不同，故分配系数与静电荷数的关系因无机盐而异.2）疏水作用一般蛋白质表面均存在疏水区，疏水区占总表面积的比例越大，疏水性越强。所以，不同蛋白质具有不同的相对疏水性。在pH为等电点的双水相中，蛋白质主要根据表面疏水性的差异产生各自的分配平衡。同时，疏水性一定的蛋白质的分配系数受双水相系统疏水性的影响。因此，有必要确定双水相系统的疏水性尺度，以便在萃取操作时调整和设计蛋白质的分配系数。PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相(PEG相)疏水性较大，相间的疏水性差用疏水性因子HF(hydrophoblcfactor)表示。HF可通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点处的分配系数maa测算lnmaa=HF(RH+B)其中，RH为氨基酸的相对疏水性(relativehydrophobicity)，是通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设疏水性最小的甘氨酸的RH＝0。B=lnmGly/HF所以，pH＝pI时氨基酸在双水相系统中的分配系数与其RH值呈线性关系，直线的斜率就是该双水相系统的HF值。利用前式可确定不同双水相系统的HF值。如果在pH为等电点的双水相中蛋白质的分配系数(m0)与HF值之间呈线性关系，则直线的斜率定义为该蛋白质的表面疏水性，用HFS(hydrophobicfactorofsolutes)表示lnm0=HF×HFS一般形式lnm=HF(HFS+ΔHFS)+ΔφFZ/RT该式较全面地描述了双水相系统的疏水性和相间电位、蛋白质的疏水性和净电荷数对分配系数的影响，同时也间接地通过盐对蛋白质表面疏水性和相间电位的影响表现了盐对蛋白质分配系数的作用。3双水相系统中目标物分配系数的影响因素•成相高聚物浓度－－界面张力•成相高聚物的相对分子量–一般来说，蛋白等高分子量物质易集中于低分子量相•电化学分配–双水相萃取时，蛋白质的分配系数受离子强度的影响很小•疏水反应•生物亲和分配•温度及其它因素双水相系统的聚合物组成(包括聚合物类型、平均分子量)，盐类(包括离子的类型和浓度、离子强度、pH值)，溶质的物理化学性质(包括分子量、等电点)以及体系的温度等。这些参数并不是独立地起作用。所以要预测溶质在双水相系统间的分配系数是困难的。这些系统复杂性表现在如下的一些例子中：在一相中引入疏水性基团会影响离子的分配和电位，在大分子(亲水聚合物或蛋