非水介质中的酶催化作用

2014/11/131第五章非水介质中的酶催化作用——非水酶学2014/11/132水是最常用的溶剂，大多数无机化学反应主要是在水溶液中进行的─这并不意味着水对一切化学反应都是唯一最合适的溶剂非水溶剂可以作为反应介质吗?在非水溶剂中反应，会得到什么样的反应结果呢?在非水溶剂中的反应产物形态(如粒径、形貌)与在水中得到的有何不同?2014/11/133非水酶学的概念研究非水介质中酶的结构特点、催化条件、酶学性质和催化机理的酶学分支学科。2014/11/134非水酶学的研究内容基本理论：非水介质中影响酶催化的因素；非水介质中的酶学性质；非水介质中的酶催化机制应用2014/11/135本章主要内容第一节非水介质中酶学基础第二节酶在非水介质中催化反应及应用2014/11/136第一节非水介质中酶学基础——观念的突破传统观念：有机溶剂是酶的变性剂、失活剂1966：胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物酶在非极性有机溶剂中有活力；1975－1983：在有机溶剂中酶催化合成酯和类固醇以及甾醇转化；1984：Klibanov报道在微水介质中酶促合成酯、肽、手性醇成功。已报道在有机介质中具有催化活性的酶大约有十几种。水解酶类：脂肪酶、酯酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶氧化还原酶类：过氧化物酶、过氧化氢酶、醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、多酚氧化酶、多细胞色素氧化酶转移酶类：醛缩酶2014/11/137非水溶剂的优点★水不溶性底物在有机溶剂中溶解度大.★酶不溶于有机介质，易于回收.★一些由水导致的副反应将不会发生(如在酸酐对蛋白质的修饰反应中，若存在水，酸酐会发生水解反应).★许多在水中热力学平衡不利的反应，在有机溶剂中可以进行，如酯的合成，肽的合成等.2014/11/138★从有机溶剂中分离纯化产物比在水中容易极性产物不溶，离心或过滤即可；非极性产物可因挥发温度不同通过蒸馏来分离★有机溶剂中酶的热稳定性与储存稳定性比水中高酶在有机溶剂中构象比较稳定2014/11/139用于酶催化的非水介质水—有机溶剂单相系统(与水混溶的极性有机溶剂和水形成的均一体系)水—有机溶剂两相系统(两相)反胶束体系；微水有机溶剂单相系统(一相)无溶剂或少溶剂反应系统超临界流体系统离子液体气相反应介质2014/11/1310一、非水介质中酶的结构与性质（一）非水介质中酶的结构（二）非水介质中的酶学性质2014/11/1311非水介质中酶的存在形式1、固态：冷冻干燥酶粉固定化酶结晶酶(催化效率高)2、可溶解酶：水溶性大分子(PEG等)共价修饰的酶非共价修饰的高分子－酶复合物表面活性剂－酶复合物(反胶束酶)(一)非水介质中酶的结构2014/11/1312酶不溶于疏水性有机溶剂，在含微量水的有机溶剂中以悬浮状态起催化作用(右图)。酶粉以悬浮状态存在于有机溶剂中2014/11/1313在有机相中酶能保持其整体结构的完整性，有机溶剂中酶的结构(至少是活性部位的结构)与水溶液中的相同。内荧光谱学和圆二色性发现木瓜蛋白酶在乙醇和乙腈中整体三级结构没有明显改变。X射线衍射技术证实了在有机相中，酶活性中心的氢键结构仍保持完整，也就是其蛋白质分子骨架的构象与水中相比没有明显的变化。电子顺磁共振技术(EPR)研究表明，固定化乙醇脱氢酶在有机溶剂中能保持其天然构象。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)发现冻干酶粉在有机溶剂中二级结构未发生明显变化。为何酶在非水介质中能表现出催化活力呢?2014/11/1314(二)非水介质中的酶学性质1.酶的(热、贮藏)稳定性：比在水中高2.底物特异性：不同底物在水中和非水介质中的表现不一样3.对映体选择性4.位置选择性5.化学键选择性6.“pH记忆”与“pH忘记”2014/11/13151.酶在非水介质中热力学稳定性提高酶条件热稳定性猪胰脂肪酶环己烷水，pH7.0T1/226h(780倍)T1/22minF1-ATP酶甲苯，70℃水，70℃T1/224h(144倍)T1/210minHindIII正庚烷，55℃，30d水，55℃，30d活力没有降低降低细胞色素氧化酶甲苯，0.3%水甲苯,1.3%水T1/24.0h(141倍)T1/21.7min2014/11/13162.非水介质对底物特异性的影响酶底物介质反应效率蛋白水解酶(水解反应)苯丙氨酸酯(疏水)丝氨酸酯(亲水)水500001蛋白水解酶(aa和醇的转酯反应)苯丙氨酸(体积大，极性小)丝氨酸(体积小、极性稍大)辛烷13与在水溶液里的酶催化一样，酶在非水介质中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性。2014/11/13173.介质对对映体选择性的影响酶底物溶剂立体选择性蛋白水解酶(水解反应)N-乙酰基丙氨酸氯乙酯疏水性有机溶剂L:D小于10同上同上水L:D1000－10000酶的对映体选择性是指酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力。由于溶剂的亲(疏)水性的变化而发生变化2014/11/1318对映体选择的规律疏水性强的有机溶剂中，酶的立体选择性差。增加体系中水的含量会提高酶的对映体选择性。但上述规律在有些情况下不一定完全符合。例如，溶剂的疏水性强弱对猪胰脂肪酶和柱状假丝酵母脂肪酶的对映体选择性的影响很小。2014/11/13194.介质对位置选择性的影响假单胞菌脂肪酶(P.cepacia)催化的酯交换反应：亲水介质中,主要得产物(b)疏水介质中,主要得产物(c)解释：酶活性中心有个疏水裂缝，辛基是疏水的。若介质亲水，辛基就易进入裂缝，辛基邻位被水解。若介质疏水，辛基溶在介质中，进不了裂缝，邻位水解不了，间位被水解。亲水介质疏水介质2014/11/1320非水介质中酶对底物的位置选择性的规律不同来源的酶对底物的反应位置不同。如猪胰脂肪酶在无水吡啶中催化各种脂肪酸的三氯乙酯与单糖的酯交换反应，作用位置是葡萄糖的1位羟基化，其他脂肪酶选择性酰化其他位置的羟基。介质的疏水性大小对酶催化的位置选择性有影响。2014/11/13215.酶催化对化学键的选择性与酰基化试剂(羧酸、酸酐)反应,-NH2形成酰胺,-OH形成酯。无脂肪酶催化,-NH2优先(说明-NH2化学活性大于-OH)；有脂肪酶催化，-OH优先(米赫毛霉脂肪酶优先催化-NH2酰化)。脂肪酶来源不同，选择性不同。同一酶催化，介质不同，选择性不同。2014/11/13226.有机溶剂对酶的记忆的影响有机溶剂中，酶能够记忆它冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液(水)中的pH；其最适pH与水相中是一致的。即所谓记忆功能。但有时例外。和溶剂、水含量有关。如果用有机酸或有机碱和它们的盐类组成有机相缓冲体系，此时酶的最适pH就不一定和冷冻干燥前相同，即酶忘记了水中的最适pH了。2014/11/1323二、水1.非水介质中水对酶活力的影响与酶结合的水量是影响酶活力、稳定性和专一性的决定因素。酶分子周围的水化层是酶表面和反应介质之间的缓冲剂，它是酶微环境的主要成分。完全“干”的体系中，酶基本无活力。最适水量（“必需水”－essentialwater，酶重量的25~38%）可使酶的动力学刚性与热力学稳定性之间达到最佳平衡点。2014/11/1324有机溶剂中水含量对酶活力的影响图有机溶剂中水含量对酶活力的影响(a)酵母醇氧化酶(b)蘑菇多酚氧化酶(c)马肝醇脱氢酶1乙醚;2乙酸丁酯；3乙酸乙酯；4辛醇；5叔戊醇；62-丁醇；7乙酸己酯；8辛醇;9乙酸乙酯;101-丁醇；11叔戊醇；12二氯甲烷;13异丙醚；14乙酸丁酯；15乙酸甲酯；16四氢呋喃；17乙腈2014/11/13252014/11/13262.水活度(aw)酶束缚(结合)水的多少(质量分数)可用水活度表示。酶束缚水的多少和水的总含量(总质量分数)及溶剂极性有关。即：aw＝YwXwaw为水活度，Yw为活度系数，Xw为水的质量分数。Yw和溶剂极性有关。溶剂极性很小时，Yw＝1；溶剂极性愈大，Yw愈小2014/11/13273.水活度怎样影响酶活力？酶促反应需要一个最佳水活度。这个概念比最适水量(水质量分数)更合理。当没有控制水活度时，通常最佳水含量会随着溶剂极性的增加而增加。最佳水活度与溶剂的极性几乎无关，大约都在0.55左右。同一种酶，催化同一种反应，即使介质溶剂不同，最佳水活度也基本相同。然而在许多体系中，即使当水活度保持恒定时，酶的催化反应速率也会改变，表明溶剂和底物性质对酶活性也有直接或间接的影响。2014/11/1328同一反应所需最佳水活度基本相同2014/11/13294.水对蛋白质运动性和酶活力的影响极性很强的水是一种增塑剂，向有机溶剂中添加水增加了酶分子结构的柔性，也增加了活性位点的极性，使“紧锁”的活性位点“开启”，运动性增加。有机溶剂中加到固态酶制剂上的水分子可以通过增加酶活性位点的极性和柔性而提高其活力。2014/11/1330水过少有什么影响？当水含量远低于最适水量时，由于有机溶剂缺乏提供形成多种氢键的能力，加之介电常数较低，导致酶蛋白分子内强烈的静电作用，此时氢键作用主要体现在酶分子内部，氨基酸残基处于一种紧密堆积状态。但是，这种过于刚性的结构虽然可以使酶在无水有机溶剂中保持二级结构不变，但却无法表现出催化活力。2014/11/1331水过多有什么影响？当水含量远高于最适水量时，大量的水分子与酶分子形成分子间氢键，此时酶处于一种十分松散的状态，柔性过大使酶的构象易于改变。——这就解释了为什么在水/极性有机混合溶剂中酶的二级结构会变化，并最终导致酶的变性失活。只有在最适水量附近时，酶才处于一种刚柔适度的状态，表现出高的催化活性。2014/11/1332三、有机溶剂对酶催化活力的影响1.有机溶剂对酶的结合水的影响2.有机溶剂对酶的影响(1)有机溶剂对酶的动态的影响(2)有机溶剂对酶结构的影响(3)有机溶剂对酶活性中心的影响(4)酶活性和溶剂属性的定量关系3.有机溶剂对底物和产物的影响2014/11/13331.有机溶剂对酶分子上结合水的影响亲水有机溶剂(极性的,如甲醇)会夺去酶表面的水(60%)使酶失活。疏水溶剂(如己烷)脱水能力较小(0.5%)。增大酶表面的亲水性(可用极性基团修饰)可以减少极性有机溶剂的脱水作用。极性溶剂不仅束缚溶剂中的水，使活度系数降低，而且夺取酶分子上的必需水，使酶活降低。2014/11/13342.有机溶剂对酶的影响(1)改变酶分子的动态移动性及构象来影响酶活性；溶剂介电常数降低，酶分子活性中心区域的活动性降低，酶活表现不出来。(2)改变酶分子的动态结构和表面结构；尽管酶整体结构及活性中心的结构保持完整，但动态结构和表面结构发生了变化。2014/11/1335(3)减少酶活性中心的数量；溶剂对酶活性中心的影响是通过减少整个酶活性中心的数量达到的。酶活性中心的数目丧失的多少取决于溶剂的疏水性大小。辛烷：损失0%；二氧六环：损失29%。(4)溶剂的极性参数、介电常数、水在溶剂中的溶解度等化学性质，几何形状等物理性质都对酶分子有影响。2014/11/13363.溶剂对底物和产物的影响直接或间接与底物或产物作用(包括化学和物理的作用)；影响酶分子必需水层中底物或产物的溶解度。因为底物必须进入必需水层，产物应该移出必需水层，反应才能顺利进行。2014/11/1337四、有机溶剂中酶催化活性和选择性的调控1.必需水2.溶剂工程2014/11/13381.必需水必需水是非水介质中酶进行催化反应所必需的当溶剂、酶等其他因素恒定的条件下，反应系统只有在最适含水量(水活度)时，才有高活力和选择性，这个值通常在0.55左右。2014/11/13392.溶剂工程基于溶剂对酶的活性、底物的扩散和分配、产物的扩散和分配有影响，提出如下原则：1、酶的微环境(水层)的极性和底物的极性尽量接近，和产物的极性相差尽可能大。2、有机溶剂的极性和产物的极性尽量接近；和底物的极性相差尽可能大。2014/11/1340提高非水介质中酶催化效率方法之一——调整体系水活度高水合盐可作为水缓冲剂，反应初期释放水，供酶使用；后期结合水，酶不结块.有水生成的反应，可加入除水剂(分子筛等).调