碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究

碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究董静201131301031摘要：以猪肝为原料，采用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制备肝匀浆，醋酸镁则有保护和稳定AKP的作用，匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。含有AKP的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。根据AKP在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。酶学性质研究表明该酶催化对磷酸苯二钠水解反应的最适PH值为10.0，最适温度为37℃,米氏常数值Km为3.154mmol/L，酶的热稳定性研究表明该酶在pH在8-9区间和温度在25℃-37℃区间下稳定。关键字：碱性磷酸酶分离纯化热稳定性酸碱稳定性碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，EC3．1．3．1，简称AKP)广泛存在于微生物界和动物界，它在动物机体的骨化过程中及在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中起着重要作用。此外，通过催化磷蛋白的水解，碱性磷酸酶在细胞调节过程中也具有一定的作用。它可专一性的水解磷酸单酯化合物而释放无机磷，主要用于核酸研究，分析、测定核苷酸顺序及其基团的重组、分离，也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一。药用化妆品中添加碱性磷酸酶有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，还可用于核苷酸脱磷产生核苷等。它是一种膜结合蛋白，在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程[1]。临床上通过测定AKP的活力，可作为诊断骨骼及肝脏疾病的重要生化指标。因此纯化和研究AKP的性质、调控等有重要意义。本实验尝试以猪肝为材料，分离纯化猪肝碱性磷酸酶，研究其酶学性质，旨在探讨以猪肝研制科研用碱性磷酸酶生化试剂的方法，同时也为进一步的深入研究该酶提供理论上的参考。此外，猪肝来源广泛，价格便宜，可以作为生产碱性磷酸酶生化试剂的原料[2-3]。研究酶的生物学特性，其之一是它对酸碱度的敏感性，pH对酶活性的影响极为显著，通常各种酶只有在一定的范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH条件下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适pH。pH不仅对酶活性有很大影响，而且对酶的稳定性也有很大的影响，而且对酶的稳定性也有很大的影响。因为该酶的化学本质是蛋白质，同蛋白质容易变性一样，酶在过酸或过碱的条件下也很容易变性失活。各种酶的酸碱度稳定范围是不同的，这就需要制作酸碱稳定性曲线[4]。对温度的敏感性是酶的又一个重要特性。酶反应速度达到最大值时的温度称为酶的最适温度。如果保持其它反应条件恒定，而在一系列变化的温度条件下测定酶活力，以温度为横坐标，反应速度为纵坐标，可得到一条温度——酶活性曲线。酶的种类和来源不同，对热的稳定性也不同，这就需要通过热稳定性试验测出热稳定范围。一般的试验方法是在一定条件下先将酶在不同的温度下处理一段时间，迅速降温，然后再在一定温度条件下测定酶活力。以处理温度为横坐标，酶反应速度为纵坐标作图，可得到酶的热稳定性曲线，根据这条曲线即可求出酶的热稳定性范围[5]。抑制剂是引起酶促反应速度降低的一类物质的统称。它与酶的活性部位结合，改变了酶活性部位的结构或性质，从而引起酶活力下降，这里不包括酶蛋白的水解或变性等情况。在可逆抑制类型中，根据抑制剂、底物和酶三者的相互关系，又可分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。在竞争性抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合，即不能形成EIS，其动力学特征是：米氏常数的表观值Km增加，酶的最大反应速度Vm不变。在非竞争性抑制中，抑制剂、底物都能同时和酶结合形成EIS，但是EIS不能进一步转变为产物，其动力学特征是：Vm降低而Km不变。在反竞争性抑制中，抑制剂必须在酶和底物结合以后才能和酶结合形成EIS，即Ki=∞，其动力学特征是：Km和Vm都发生了变化[6]。1材料与方法1.1材料1.1.1原料菜市场购买的新鲜猪肝，由本实验室保存。1.1.2主要仪器移液管；量筒；玻璃勺浆器(管)；剪刀；离心机（湘仪CenceH2050R）为湖南湘仪实验室仪器开发有限公产品；新华定性滤纸；HH数显恒温水浴锅为金坛市金城国胜实验仪器产品；721型分光光度计（UNIC7200SPECTROPHOTOMETER）为国产分光光度计。1.1.3试剂①0.5mol/L醋酸镁溶液：107.25g醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000ml;②0.1mol/L酸钠溶液:8.2g醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000ml;③0.01mol/L醋酸镁-0.0lmol/L醋酸钠溶液:准确吸取20ml0.5mol/L醋酸镁溶100ml0.14mol/L醋酸钠溶液，混合后定容至1000ml；④tris-hclph8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，即为0.1mol/LTris溶液.取100ml10.1mol/LTris溶液，加蒸馏水约780mL，再加0.1mol/L醋酸镁溶液100ml，混匀后用1%冰醋酸调ph为8.8，用蒸馏水定容至1000ml；⑤正丁醇、丙酮、95%乙醇；⑥0.04mol/l作用物液：称取10.16g磷酸苯二钠，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解，并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，贮于棕色瓶子内，置冰箱内保存；⑦0.1mol/l碳酸盐缓冲液（ph10.0）：称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g溶解于蒸馏水中，并稀释至1000ml；⑧碱性磷酸酶液：取纯化的碱性磷酸酶5mg，用ph10缓冲液配制成100ml，放置冰箱内保存;⑨0.5mol/lNaOH溶液;100.3%4-氨基安替比林:称取3g4-氨替比林及碳酸氢钠42g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000ml，贮于棕色瓶中，放冰箱内保存；○110.5%铁氰化钾：称取10g铁氰化钾及30g硼酸各溶于800ml蒸馏水中，溶解后两液混合加水至2000ml。置棕色瓶中，放冰箱内保存；○12基质液：称取磷酸苯二钠·2H2O6g,4-氨基安替比林3g，分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中，两液混合并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，于棕色瓶内，用时与等量的水混合即可;○13各ph值相应缓冲液，○140.5mol/LKH2PO4：称取KH2PO46.80g，加水溶解并定容至100ml；○150.04M磷酸氢二钠：称取磷酸氢二钠14.3g，溶解于0.1MpH10的碳酸缓冲液中，并用此液稀释至1000ml。1.2方法1.2.1提取方法分离纯化碱性磷酸酶的操作流程如下（以下操作均在0-4℃进行）加10ml正丁醇，搅拌3-5分钟后，四层纱布过滤后，离心30min，2500r/min加23.5ml冷丙酮（-10℃）混匀，冰冻离心2500转5分钟加0.5moL/l醋酸镁20ml，量体积为29ml加96%乙醇12,95ml离心3000转5分钟加96%乙醇27.9ml，离心2500转5分钟0.01mol/L醋酸镁-0.0lmol/L醋酸钠20ml溶解，加96%乙醇9.75ml，离心2500转5分钟加96%乙醇24.5ml，离心2500转5分钟取新鲜猪肝10g剪碎（0-4℃）肝匀浆体积32.5ml滤液23,5ml上清液（弃去）沉淀悬液沉淀（弃去）上清液33.5ml上清液（弃去）沉淀沉淀（弃去）上清液29.5ml加0.01mol/L醋酸镁-0.0lmol/L醋酸钠60ml，在电动匀浆上匀浆。加0.5mol/L磷酸镁15ml溶解，总体积17.5ml，加99.5%丙酮16.4ml，离心2500转5分钟加丙酮7.65ml至50%，离心4000转10分钟上清液（弃去）沉淀沉淀（弃去）上清液上清液（弃去）沉淀：加pH8.8Tris缓冲液10ml，分装保存，1ml1管，在-20℃下保存10管。1.2.2Km值测定方法①取大试管7支，按表1分别加入相应试剂，加入酶液，混匀之后立即计时，各管在37℃水浴中准确保温15分钟后，立即加入0.5molNaOH液1.0ml以终止反应；②各管中加入0.3%4-氨基安替比林1.0ml和0.5%铁氰化钾2.0ml，充分混匀，放置10分钟，以0管为对照，在波长510nm下比色，记录各管的吸光度；③作图：所测各管的吸光度代表各管中反应速度v，以之为纵轴，以作用物浓度[S]为横轴，在坐标纸上连接各点作图，以观察曲线的形状。以各管吸光度值的倒数为纵坐标轴，以作用物浓度的倒数为横坐标，作图并求出此酶的Km值。表1Km值测定曲线制作试剂管号（ml）123456700.04mol/L作用物液0.150.200.250.300.400.600.800pH10磷酸缓冲液0.900.900.900.900.900.900.900.90蒸馏水0.850.800.750.700.600.400.200混匀37℃预热5分钟酶液0.10.10.10.10.10.10.10.11.2.3最适pH及酸碱稳定性实验①pH—活性曲线的制作取6支试管，按表2操作，以反应pH值为横坐标，A510为纵坐标绘制pH活性曲线，求出碱性磷酸酶在本实验条件下的最适pH值。表2pH—活性曲线制作管号123450反应pH8910111210相应pH缓冲液各加0.5ml酶液各加0.1ml（0号管酶液在铁氰化钾之后加）/37℃预热5分钟预热的基质液各加3.0ml37℃精确保温15min后各加1,0ml碱性溶液终止反应0.5%铁氰化钾各加2.0mlA510②酸碱稳定范围的测定取6支试管，按表3操作，以pH为横坐标，A510为纵坐标，绘制酸碱稳定曲线，并分析碱性磷酸酶的酸碱稳定范围。表3酸碱稳定范围曲线的制作管号123450处理pH8910111210相应pH缓冲液各加0.1ml酶液各加0.1ml37℃保温处理1h0.1MPH10碳酸盐缓冲液各加0.5ml预热的基质液各加3.0ml（0号管基质液在铁氰化钾之后加）0.5%铁氰化钾各加0.2mlA5101.2.4最适温度及热稳定性实验①温度—活性曲线的制作取4支试管，按表4操作，以反应温度为横坐标，A510为纵坐标，绘制温度—活性曲线图，求出碱性磷酸酶在本实验条件下的最适温度。表4温度—活性曲线制作管号1230反应温度（℃）25378037稀释酶液各加0.1ml（0号管在铁氰化钾之后加）预热复合基质液各加3.0ml分别在不同温度下精确反应15min，各加1.0ml碱性溶液终止反应各加0.5%铁氰化钾2.0ml，静置10minA510②热稳定性测定取4支试管，按表5操作，在上述相应温度的恒温水浴锅内放置相应时间后取出，立即以流动水冷却并置于37℃恒温水浴锅中预热2分钟，以处理温度为横坐标，A510为纵坐标，绘制处理时间为15min的热稳定曲线，并分析在本实验条件下碱性磷酸酶的热稳定范围。表5热稳定范围曲线制作管号1230热处理温度（℃）25378025热处理时间（分）各15酶液（ml）各加0.1ml（0号管在铁氰化钾之后加）37℃预热的复合基质各加3.0ml37℃精确反应15min后各加1,0ml碱性溶液终止反应0.5%铁氰化钾各加0.2mlA5101.2.5抑制剂类型鉴别取5支试管，按表6操作，以反应速度倒数1/V或1/A510为纵坐标，以底物浓度倒数1/[S]为横坐标，作图，观察直线在纵轴和横轴上的交点位置并计算其K值，与未加抑制时的Km值比较。说明该抑制剂属于何种类型。表6抑制剂类型曲线制作管号1234040mmol./L底物浓度0.100.150.200.300碳酸盐缓冲液0.90.90.90.90.9蒸馏水0.800.750.700.600.900.25MKH2PO40.10.10.10.10.1混匀，37℃预热5min酶液0.10.10.10.10.1最终底物浓度（mmol/L）0.10.10.10.10.1按顺序各加1.0ml碱性溶液，1ml4-氨基安替比林，2ml铁氰化钾A5102.结果与分析2.1Km值的测定表7Km值测定实验各管光吸收值管号123456700.04mol/L作用物液0.150.200.250.300.400.600.800光吸收值0.