碱性磷酸酶的提取

碱性磷酸酶的提取及其分离纯化制作人：周晓玲碱性磷酸酶介绍以及应用碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,简称AKP),是一种有广泛使用价值的生化试剂,可专一性地水解磷酸单酯化合物而释放无机磷。主要用于核酸研究,分析、测定核苷酸顺序及其基因的重组、分离,也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一,药用化妆品中添加AKP有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢,还可用于核苷酸脱磷生产核苷等。碱性磷酸酶的制备来源a)AKP多数是从动物如小牛(或猪、鸡)肠粘膜、牛脾等动物脏器中提取制备，一般商品化的AKP都是从小牛肠道中分离得到。b)AKP很少很少从微生物中分离，因为如果用原核表达，很可能造成折叠有问题，不一定有正确的酶活力。碱性磷酸酶的提取方法——有机溶剂沉淀法原理：乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂可以通过降低介质的介电常数及对酶蛋白的脱水作用而降低酶的溶解度。AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和其他蛋白分离，从而得到纯化。反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。221reeF碱性磷酸酶的提取方法——有机溶剂沉淀法常用的有机溶剂：乙醇:沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析.丙酮:沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广.正丁醇:能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解在溶液中.取动物组织于研钵中剪碎加0.01M醋酸镁-0.01M醋酸钠研磨2-3分钟转移入刻度离心管于离心管中加入正丁醇，用玻棒充分搅拌2分钟左右室温静置20分钟用滤纸过滤滤液(V)弃渣提取操作流程a）提取操作流程b）滤液(V)加入等体积冷丙酮，立即混匀后离心（2000转/分）5分钟上清液沉淀加入0.5M醋酸镁，用玻棒充分搅拌,记录体积(V1)向溶液中缓慢加入95%冷乙醇X1ml(X1=0.46V1)，使乙醇终浓度达30%提取操作流程c）向溶液中缓慢加入95%冷乙醇X1ml(X1=0.46V1)使乙醇终浓度达30%混匀后离心（2000转/分）5分钟上清液(V2)沉淀加入冷95%乙醇X2ml(X2=0.857V2),使乙醇最终浓度达60%混匀后离心（2000转/分）5分钟上清液沉淀加0.5M醋酸镁充分溶解加入0.1mlpH8.8Tris缓冲液（-20°冰箱保存）AKP纯化程度鉴定a)纯化程度用酶的比活性反映。b）酶比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。每ml制剂中AKP活性单位数（U）①每ml制剂中蛋白质含量（mg）②AKP比活性（U/mg）=①APK的活性测定—磷酸苯二钠为底物的金氏法a)酶活力单位定义:1mLO.lmol/L的碳酸盐缓冲液(PH值10.0),加入1ml0.01mol/L的磷酸苯二钠,37℃预热5min,然后加人0.1ml酶液,混匀后于37℃保温15min,再加人3ml铁氢化钾,最后在510mm波长下测定,产生1umol酚的酶量为一个活力单位(U)。b)原理：在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大小。②AKP的蛋白含量测定—BCA法a)蛋白质＋Cu碱性CuBCA试剂紫色化合物2+b）利用分光光度计测吸光度+原理：BCA(bicinchoninincacid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。c）设计标准曲线计算蛋白质含量使用BCA法测定蛋白含量的原因a)对酶的比活力测定中蛋白定量发现BCA法在本样品体系中灵敏度高、抗干扰能力强，适合采用此法进行蛋白含量测定。b）与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。研究与讨论a)可以结合SDSPAGE法检测纯化结果。b）可以使用等电聚焦电泳来检验酶样品的均一度。c）可以结合使用其他检测方法，如可以使用福林-酚试剂显色法用来测定蛋白质浓度。用盐分级沉淀法来进行分离纯化等。