彗星试验步骤

彗星试验步骤1.5.4彗星试验（单细胞凝胶电泳试验）：参照文献[i]，略加改动，进行碱性单细胞凝胶电泳，具体如下。1.5.4.1制片将0.6%的NMPA（用PBS配制）于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用。1.5.4.2铺胶取1.5.3中所备细胞悬液10l，向其中加入70l37℃0.7%LMPA（用PBS配制），混匀后迅速滴于37℃预热的玻片上，立即盖上盖玻片，4℃固化10min。1.5.4.3裂解轻轻取下盖玻片，将玻片浸于新鲜配制并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1h。1.5.4.4解旋从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3×3min。用纸巾吸去玻片上残留的液体，置于水平电泳槽中，加新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm以上，避光解旋30min。1.5.4.5电泳电压25V，调整液面高度使电流达到300mA，电泳25min。1.5.4.6漂洗及染色电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2×15min，以中和强碱。用纸巾吸去玻片上残留的液体，然后滴加20g/ml的EB20l，盖上盖玻片，立即置荧光显微镜下观察。以上步骤尽量在黄光下或暗处进行，避免其他原因所致的DNA损伤。每一剂量水平制片2张。1.5.4.7结果观察荧光显微镜下200倍观察，激发波长515~560nm，发射波长590nm。每一剂量水平随机观察100个细胞，记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率（以下简称拖尾率），拖尾率＝(拖尾细胞数/100)×100%。每一剂量水平用目镜测微尺测量30个拖尾细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（以下简称尾长，taillength，TL）＝全长－头长，计算各剂量组的平均尾长。表1.1MMS、MMC和NaN3的WTK1细胞彗星试验结果Table1.1CometassayofMMS,MMCandNaN3withWTK1celllineChemicalConc.(g/ml)0h20hRGa(%)Cometcell(%)TL(x±s,m)RGa(%)Cometcell(%)TL(x±s,m)MMS0100.06.03.50±1.69100.03.03.67±3.130.62597.210.010.38±2.92**98.88.06.50±3.05**1.25100.418.0*24.25±4.88**97.711.08.90±3.52**2.596.433.0**32.08±7.40**88.315.0**18.62±4.04**594.860.0**52.33±5.68**86.844.0**46.00±5.36**K2Cr2O714792.4100.0**78.70±4.39**－－－MMC0100.06.02.57±1.76100.05.01.75±1.760.0625100.46.03.70±1.8696.29.03.62±1.920.125108.110.04.04±1.5254.619.0**5.50±1.81**0.25104.511.03.92±1.4252.750.0**22.87±3.95**0.587.817.0*4.93±3.6348.864.0**50.17±5.80**K2Cr2O7147105.4100.0**68.19±5.15**－－－NaN30100.08.03.12±1.69100.09.02.15±1.6725090.07.03.03±1.4899.06.02.85±1.58500102.58.03.35±1.1697.79.03.10±1.83100089.414.04.09±1.5788.311.03.16±1.29200092.256.0**14.93±4.54**86.852.0**11.25±1.38**K2Cr2O714792.5100.0**72.33±6.12**－－－aRelativegrowthcomparedwithcorrespondingsolventcontrol*P0.05**P0.01,comparedwithcorrespondingsolventcontrol