第七章-非水介质中酶的催化反应

酶工程第七章酶的非水相催化主要内容非水酶学概述1非水介质中酶的结构与性质2水的作用及其调控有机溶剂的影响345酶非水相催化的应用第一节非水酶学概述一、非水相酶学研究简史水是酶促反应最常用的介质传统观点认为酶只能在水溶液中发挥作用，酶一旦与有机溶剂接触，就失去活性。水作为反应介质有一定的缺陷2019/11/174第7章酶的非水相催化对大多数有机化合物来说，水并不是适宜的溶剂；水的存在有利于某些副反应发生（水解、消旋化、聚合等）。一、非水相酶学研究简史20世纪初，Bourquelot等人，将微量乙醇、丙酮等有机溶剂加到酶的水溶液中，酶活性降低。1966年以来，Dostoli和Siegel分别报道胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物酶在几种非极性溶剂中具有催化活力。1975-1983年，Buckland和Martinek等探讨了微生物细胞、游离酶和固定化酶在有机溶剂中合成脂类和类固醇及甾醇的转化。2019/11/175第7章酶的非水相催化一、非水相酶学研究简史酶在有机溶剂中能进行催化反应2019/11/1761984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。标志着酶的非水相催化获得突破性进展结论只要条件合适，酶可在疏水介质中催化天然或非天然疏水性底物转化，酶可在水与有机溶剂互溶体系、水与有机溶剂组成的双液相体系、仅含微量水或几乎无水的有机溶剂中表现出催化活性。第7章酶的非水相催化二、非水相催化的特点和优势2019/11/177（1）提高疏水性底物的溶解度；（2）酶不溶于有机溶剂，易于回收再利用；（3）酶的热稳定性和储存稳定性增加；（4）改变反应平衡方向，催化水中不能进行的反应；（5）抑制依赖水的副反应的发生；（6）防止微生物污染；（7）低沸点的溶剂中，产物易于分离纯化第7章酶的非水相催化三、非水相酶催化的主要类型2019/11/178（一）有机介质的酶催化（二）气相介质的酶催化（三）超临界流体中的酶催化（四）离子液体中的酶催化第7章酶的非水相催化（一）有机介质中的酶催化2019/11/179酶在含一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。第7章酶的非水相催化微水有机溶剂体系水互溶有机溶剂单相体系水-有机溶剂两相体系正胶束、反胶束体系1、微水有机溶剂体系2019/11/1710用疏水性有机溶剂取代几乎所有的水，保留部分水作为必需的结合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。第7章酶的非水相催化酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机溶剂中，在悬浮状态下进行反应；有机溶剂通常为烷烃、芳香族化合物、卤代烃、醚等。2、水互溶有机溶剂单相体系2019/11/1711由水和与水互溶的有机助溶剂（10%~20%）组成的反应体系。第7章酶的非水相催化酶、底物、产物均能溶解于该体系中；主要适用于在单一水溶液中溶解度很低、反应速度很慢的疏水性底物的生物转化；常用有机溶剂：二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）、四氢呋喃（THF）、丙酮和低级醇等。3、水-有机溶剂两相体系2019/11/1712由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相体系。疏水性底物和产物溶解于有机相中，酶溶解于水相中，催化反应在两相界面进行。第7章酶的非水相催化选择适当的有机溶剂，适度调节水相中pH、盐浓度等，可控制反应物在两相中的分配，进而缓解均相系统中底物和产物的抑制；常用有机溶剂：烃类、醚、酯等。4、正胶束与反胶束体系2019/11/1713正胶束体系：水为主体，表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，酶在水相中，疏水性底物在正胶束内部的有机相中，反应在胶束两相界面进行反胶束体系：有机溶剂为主体，表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，疏水性底物在有机相中，酶在反胶束内部的水相中，反应在胶束两相界面进行第7章酶的非水相催化胶束体系示意图水包油油包水（二）气相介质中的酶催化2019/11/1715酶在气相介质中进行的酶催化反应。第7章酶的非水相催化适用范围：底物是气体或能转化成气体（易挥发）的物质。醇氧化酶气相中的催化反应（三）超临界流体中的酶催化2019/11/1716超临界流体：温度和压力超过某物质超临界点的流体。常用超临界流体：二氧化碳、二氧化硫、二氧化氮、烷烃（甲烷、乙烯、丙烷）氟利昂（CF3H）。第7章酶的非水相催化优点：①有利于底物、产物、酶三者的分离；②分离不需要使用有机溶剂，无残留，不产生含有机试剂的废水；③超临界流体具有气体的高扩散系数、低粘度和低表面张力，底物向酶的传递速率加快，使反应速率提高。（四）离子液体中的酶催化2019/11/1717酶在离子液体中的催化反应离子液体：由有机阳离子和有机阴离子构成的，在室温下呈液态低熔点盐类。特点：挥发性低、稳定性好，酶在其中具有良好的稳定性、区域选择性、立体选择性和键选择性。第7章酶的非水相催化第二节非水介质中酶的结构与性质一、非水介质中酶的结构2019/11/1719非水介质中酶的状态固态酶：以固体形式存在于有机相中冷冻干燥的酶粉固定化酶结晶酶可溶解酶水溶性大分子共价修饰酶非共价修饰的高分子/酶复合物表面活性剂/酶复合物微乳液中的酶第7章酶的非水相催化一、非水介质中酶的结构2019/11/1720活性位点和机制酶在有机相中能保持其结构的完整性，酶活性部位的结构与在水溶液中是相同的。有机溶剂中酶反应机制与水溶液中酶反应机制相同。同样遵循米氏方程；最适pH相同。第7章酶的非水相催化一、非水介质中酶的结构2019/11/1721有机溶剂中酶分子的柔性第7章酶的非水相催化（蛋白内部氨基酸之间）紧密状态开启状态破坏分子内氢键蛋白质结构变得松散一、非水介质中酶的结构2019/11/1722有机溶剂中酶分子的柔性第7章酶的非水相催化酶分子在“紧密”和“开启”两种状态中处于动态平衡，展现出一定的柔性。在非水溶剂中，酶所需的水能给予酶分子构象上足够的柔性，而使其具有催化活性。当介质中水含量降低时，酶的柔性降低，其活性部位变得难以接收体积较大的底物，而活性降低。二、非水介质中酶的性质2019/11/1723（一）酶的热稳定性提高第7章酶的非水相催化酶分子的热变性过程中，水是一个必要参与者。二硫键的水解Asp处肽键的水解Asn、Gln脱酰胺基非水介质中缺水使酶热变性相关反应被抑制，使热酶稳定性提高（二）酶的特异性发生变化2019/11/17241、底物特异性第7章酶的非水相催化在水溶液中，底物与酶活性中心主要依靠疏水作用结合。底物疏水性越强，越容易与活性中心结合，催化速率越高。有机介质中，酶活性中心结合部位与底物的结合状态发生变化，致使酶的底物特异性发生变化。2019/11/1725第7章酶的非水相催化极性弱疏水性强极性强疏水性弱极性较强（疏水性弱）的溶剂中，疏水性强的底物容易发生反应；极性较弱（疏水性强）的溶剂中，疏水性弱的底物容易发生反应N-乙酰苯丙氨酸甲酯疏水性强N-乙酰丝氨酸甲酯疏水性弱在不同的有机介质中，酶的底物专一性不一样（二）酶的特异性发生变化2019/11/17262、对映体选择性第7章酶的非水相催化酶的对映体选择性，是酶在外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。酶立体选择性的强弱可以用立体选择系数（KLD）的大小来衡量。立体选择系数与酶对L-型和D-型两种异构体的酶转换数（Kcat）和米氏常数（Km）有关。DmcatLmcatLD)K/K()K/K(K立体选择系数越大，表明酶催化的对映体选择性越强（二）酶的特异性发生变化2019/11/17272、对映体选择性第7章酶的非水相催化酶在水溶液中催化的对映体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中对映体选择性较差。（二）酶的特异性发生变化2019/11/17284、化学键选择性第7章酶的非水相催化酶对底物分子中几个相同官能团中的一个具有优先反应能力。酶的区域选择性随介质疏水性的不同而改变。2-辛基-1,4-苯二酚二丁酸脂与丁醇的转酯化反应1位酯和4位酯被醇解的速率随溶剂疏水性的变化而不同（二）酶的特异性发生变化2019/11/17294、化学键专一性第7章酶的非水相催化酶对底物分子中几个化学键中的一个具有优先反应能力。有机介质的加入对酶的键专一性有显著的影响。第三节水的作用及其调控水对催化反应的影响2019/11/1731酶都溶于水，只有在一定量水存在时，酶分子才能进行催化反应。酶在有机介质中反应时必须有水。第7章酶的非水相催化有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。一、水-酶构象的润滑剂2019/11/1732水直接或者间接地参与了酶天然构象中所有的非共价相互作用，包括氢键、静电作用、疏水相互作用和范德华力。第7章酶的非水相催化无水状态下，酶的带电基团和极性基团之间相互作用，形成非活性的“封闭结构”。加入水可削弱这种相互作用，使“封闭结构”变成活性“疏松结构”，并通过非共价键维持酶的催化活性构象。一、水-酶构象的润滑剂2019/11/1733酶分子需要一层水化层来维持其完整的天然构象。维持酶分子完整的天然构象所必需的最低水量称为必须水。第7章酶的非水相催化一、水-酶构象的润滑剂2019/11/1734在水含量较低的情况下，水浓度的提高使酶极性中心的极性和柔韧性提高，从而使酶活力升高。过量的水使酶活性中心内部形成水簇，改变活性中心结构，导致酶活力降低。第7章酶的非水相催化反应速度与有机介质中含水量的关系最适水量最适水量随着反应介质、底物、产物、酶、固定化载体等的变化而变化。二、水分测定与水活度2019/11/1735水在反应体系中会发生分配，直至平衡，直接以溶剂中的水含量计算酶的结合水会出现误差，可用水活度来反映酶分子结合水的量。水活度（aw）：在一定温度和压力下，反应体系中水的蒸汽分压与相同条件下纯水的蒸气压之比。第7章酶的非水相催化a𝒘=𝑷𝑷𝟎第四节有机溶剂的影响一、有机溶剂对酶的影响2019/11/1737有机溶剂与底物竞争酶的活性中心，降低底物与酶的结合能力，从而降低催化活性。极性较强的有机溶剂，如甲醇、乙醇等，会夺取酶分子的结合水，极性越强，夺取结合水的能力越强，从而降低酶的催化活性，甚至使酶失活。酶的必须水层使底物和产物分布的中介，有机溶剂能改变必须水层中底物和产物的浓度。第7章酶的非水相催化有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入“必需水”层有机溶剂极性强，亲水性强，疏水性底物在有机溶剂中溶解度太低二、有机溶剂的极性与lgP2019/11/1738有机溶剂极性强弱可用极性系数lgP表示。P：溶剂在正辛烷和水两相中的分配系数第7章酶的非水相催化lgP越大，表明溶剂极性越小lgP越小，表明溶剂极性越大lgP水中溶解度/%（20oC）酶催化活力lgP≤20.4+2＜lgP≤40.04~0.4++lgP40.4+++三、介质工程有机溶剂的选择2019/11/1739第7章酶的非水相催化介质工程：通过对催化剂微环境的修饰或向体系中增加辅助剂，引入固体基质或改变液相介质本身的组成等手段，提高酶的催化活性和稳定性，从而达到高产率的目的。辅助剂：能维持催化剂的稳定性，且基本不影响酶催化活力的物质。如甘油、乙二醇、糖类、多元醇聚合物等。维持天然构象所必须的疏水相互作用，保护水化层；大量添加提高反应介质粘度，降低传质速率和反应速率。三、介质工程有机溶剂的选择2019/11/1740极性中等；廉价易得；对底物和产物的溶解度要好；溶剂本身不参与反应；产物易于从溶剂中分离。第7章酶的非水相催化第五节酶非水相催化的应用一、有机介质中酶催化反应的条件及其控制2019/11/1742第7章酶的非水相催化酶在有机介质中可以催化多种反应，主要包括：合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、