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非水介质的酶促反应生物工程学院常雅宁第四章非水介质中的酶反应•第一节有机介质中的酶促反应概述•第二节有机介质中酶促反应的条件•第三节有机介质对酶性质的影响•第四节有机介质中酶促反应应用（生物能源）•第五节超临界流体中的酶促反应有机相酶催化历史•古代：•Hill.A.C(1898)J.Chem.Soc,73,634-658•Kastlc,J.C.andLocvCnhart,A.a.(1900)AmChem,J,24,491-525•Sym,E,A(1933)Biochem,Z,258,304-324•Sym,E,A(1936)Enzymologia1,156-160•失败的原因？有机相酶催化历史•近代有机相酶催化研究再次起飞的里程碑•Zaks,A.andKilbanov,A.M(1984),Science224,1249-1251•ZoKs,A.andKilbanov,A.M.(1985),Proc.Natl,Acad,Sci.u.s.a.82,3192-3196•成功的原因？Klibanov的实验非水介质的组成•有机溶剂•超临界流体•气相介质•低共熔混合体系：两种或多种固体化合物混合而得到的具有一个最低共熔点的状态。•热点：介质工程、溶剂工程•改变反应介质来改变酶催化反应的选择性，从而达到人为的改变和控制酶的立体专一性。第一节有机介质中的酶促反应概述•一．有机介质酶反应的应用现状•二.有机介质酶反应的优点•三.有机介质酶研究热点•四.有机介质酶反应具备条件一有机介质酶反应的应用现状•酶催化反应应用•蛋白酶肽合成合成多肽酰基化糖类酰基化羟基化酶氧化甾体转化过氧化物酶聚合酚类、胺类化合物的聚合胆固醇氧化酶氧化胆固醇测定醇脱氢酶酯化有机硅醇的酯化一有机介质中酶催化的应用•酶催化反应应用•脂肪酶肽合成青霉素G前体肽合成酯合成醇与有机酸合成酯类转酯各类酯类生产聚合二酯的选择性聚合酰基化甘醇的酰基化二．有机相酶反应的优点：•1．有利于疏水性底物的反应，能催化在水中不能进行的反应•2．可提高酶的热稳定性.3．可改变反应平衡移动方向•4.可控制底物专一性•5.酶和产物易于回收。•6.可避免微生物污染。三.研究热点•仿水溶剂和印迹技术•（1）仿水溶剂体系•（2）分子印迹技术（1）仿水溶剂体系•思路：水在酶催化反应中的作用（具有高介电常数和形成氢键的能力）结论：有机溶剂可以替代部分水（1）仿水溶剂体系•概念•可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水，从而影响酶的活性和立体选择性。称为仿水溶剂体系。极性添加剂对体系的影响•a.对反应体系内水的分配影响•b.与蛋白质的直接作用•c.对产物分配的影响•结论：作为辅助溶剂应该具有高介电常数和多点形成氢键的能力。有机相生物印迹酶枯草杆菌蛋白酶溶液含N-Ac-Tyr-NH2冻干除去抑制剂枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶溶液不含N-Ac-Tyr-NH2冻干枯草杆菌蛋白酶（1）（2）在辛烷中催化酯化反应的速度比较：反应（1）中得到的酶比反应（2）中得到的酶高100倍在水溶液中其活性：相同有机相生物印迹酶酶的水解活力与溶解酶的缓冲液pH值有很大关系有机相生物印迹酶概念：酶在含有其配体的缓冲液中，肽链与配体之间的氢键等相互作用使酶的构象改变，这种新构象除去配体后在无水有机溶剂中仍可保持，并且酶通过氢键能特异地结合该配体，这种方法叫生物印迹。利用酶与配体的相互作用，诱导、改变酶的构象，制备具有结合该配体及其类似物能力的新酶称为生物印迹酶有机相生物印迹酶为什么在有机相中会产生印迹现象？水刚性有机相生物印迹酶水在酶催化反应中的作用•水直接或间接参与了酶天然构象中所有的非共价相互作用•水充当了酶结构的“润滑剂”，使酶分子的柔性增强有机相生物印迹酶有机相中刚性增强原因？四．有机相酶反应具备条件•1．保证必需水含量。•2．选择合适的酶及酶形式。•3．选择合适的溶剂及反应体系。•4．选择合适pH值。第二节有机介质中酶促反应的条件•1．保证必需水含量•2．选择合适的酶及酶形式•3．选择合适的溶剂及反应体系•4．选择最佳pH值和离子强度一必需水猪胰脂肪催化甘油三丁酸酯和正庚醇的转酯反应必需水一必需水1概念：紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量水称为必需水2．干燥的酶水合过程：•溶菌酶为例：•（1）结合水量在0-7%g/g（水/酶），•（2）结合水量在7-25%g/g（水/酶），•（3）结合水量在25-38%g/g（水/酶），•（4）酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖2．酶活与水的关系：•酶活最大时——蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性（柔性）之间达到最佳平衡点。•“刚柔并济”•3．影响酶必需水含量的因素（酶和溶剂）a．不同酶需水量不同•在辛烷中糜蛋白酶催化仅需吸附50个水分子，而脂肪酶仅需几个水分子就可显示出活性。3．影响酶必需水含量的因素•b.同一种酶在不同有机溶剂中最适反应需水量不同•溶剂疏水性越强，需水量越少。4．表征必需水作用的参数---热力学水活度•水活度（wateractivity)：•指特定的温度和压力条件下，反应体系中水的摩尔分数Xw与水活度系数гw的乘积：аw=гw*Xw•水活度系数гw是溶剂疏水性的函数，溶剂疏水性越大，гw越大。•аw是一个强质性质的物理量，在平衡状态时，反应体系中各组分（酶、溶剂、底物和产物）的аw是相同的。研究水活度的意义：•1最佳水活度与溶剂的极性几乎无关，大约在0.55左右•2可以排除溶剂对最适含水量的影响•3水活度可由反应体系中水的蒸汽压除以在相同条件下纯水的蒸汽压而测得。获得恒定水活度的方法：•1用一个饱和盐水溶液分别预平衡底物溶液和酶制剂。•2向反应体系中直接加一种水合盐•3向每一溶剂中加入不同量的水水活度缓冲体系二酶的选择•1酶参加的反应：合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应•参加反应酶的种类选择除与反应类型有关，还与酶-底物、产物-溶剂间关系有关。常用酶的分类•（1）氧化还原酶类：•（2）水解酶类•（3）异构酶2．酶形式的选择•两大类：•第一类是固态酶，冷冻干燥的酶粉和固定化酶，结晶酶•第二类是可溶解酶，共价修饰酶和非共价修饰的高分子-酶复合物、表面活性剂复合物以微乳液中的酶2．酶形式的选择•（1）酶粉：-酶蛋白分子骨架的构象与水中无明显变化•例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应，发现在水含量不变的前提下酶催化活性加入酶粉量有最佳值，不是越多越好。2．酶形式的选择•（２）化学修饰酶：2．酶形式的选择•（３）固定化酶：•把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其对抗有机介质变性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高。2．酶形式的选择•（３）固定化酶：有机相中固定化后载体对酶的影响•A.载体能通过分配效应剧烈地改变酶微环境中底物和产物的局部浓度。有机相中固定化后载体对酶的影响•B.载体影响酶分子上的结合水•通过选择合适的载体可使体系中的水进行有利分配。有机相中固定化后载体对酶的影响•C.通过载体与酶之间形成的多点结合作用，可稳定酶的催化活性构象。有机相中固定化后载体对酶的影响•D.酶动力学影响一个酶同时催化的两个反应的相对速度。3溶剂和反应体系的选择3溶剂和反应体系的选择•酶促反应有机介质体系•（1）单相共溶剂体系（水/水溶性有机熔剂）•（２）两相体系（水/水不溶性有机溶剂）•（３）低水有机溶剂体系（有机溶剂体系）•（４）反胶束体系☆A.反胶束体系概念A.反胶束体系概念•反胶束体系：•是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的热力学稳定的系统。概念表面活性剂•表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。•在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂：•AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。概念临胶束浓度•临胶束浓度：是胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示。•CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变（如表面张力、渗透压等）来确定。微团形成示意图概念•正常微团：极性头部向外，与水结合；疏水尾部向内，形成一个非极性的核心。•反向微团：疏水尾部向外，与非极性的有机溶剂接触；极性头部向内，形成一个极性核。B.反胶束体系的制备•将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度（CMC），便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体则为反胶束。反胶束体系的制备影响因素•反胶束的尺寸和形状随表面活性剂-溶剂系统的变化而变化，同时也受温度、压力、离子强度的影响。•反胶束的大小取决于反胶束的含水量Wo。Wo的定义为反胶束中水分子数与表面活性剂分子数之比，也即有机溶剂中水的摩尔浓度与表面活性剂的摩尔浓度之比。反胶束体系中的含水量C．基本原理：“水壳”模型•反胶束系统中的水通常可分为结合水和自由水。•结合水是指位于反胶束内部形成水池的那部分水•自由水即为存在于水相中的那部分水“水壳”模型•水壳模型很好地解释了蛋白质在反胶束内的状况，其间接证据较多。•1.从弹性光散射的研究证实在蛋白质分子周围至少存在一个单分子的水层。•2.α-糜蛋白酶在反胶束中的荧光特性与在主体水中的特性很相象。•3.反胶束中酶显示的动力学特性接近于在主体水中的特性。构建双水相体系实现在线产物分离TopphaseBottomphaseSubstratesProductProductSideproductBiocatalystAquousTwoPhaseSystem--ATPS双水相体系将头孢立新得率提高3倍010203040506070060120180240300360Time(min)Cephalexinyield(%)aqueousphaseATPSBiochemicalEngineeringJournal,2002,11(2-3):95-100.J.MicrobiologyandBiotechnology,2004,14(1):62-67.双相体系与水相体系中产物纯度的比较双相体系中，由于乙酸丁酯对产物苯乙酸的萃取，促进了酶反应的平衡，使得L-型底物的转化率为99.95％，而这样得到的D-叔亮氨酸的纯度也提高到99.5％。2．有机溶剂影响酶催化的方式•(1）有机溶剂能通过直接与酶相互作用引起抑制或失活A增大酶反应的活化能来降低酶反应速度B降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键，使酶活性下降。C酶三级结构变化，间接改变酶活性中心结构影响失活。2．有机溶剂影响酶催化的方式•（2）有机溶剂与扩散的底物或产物相互作用而影响酶活2．有机溶剂影响酶催化的方式•（3）有机溶剂直接与酶附近的必需水相互作用。3．选择有机溶剂必须考虑因素•(1).有机溶剂与反应的匹配性（即相容性）（包括反应产物与溶剂的匹配性，极性产物倾向于保留在酶附近，可能引起产物抑制或不必要的副反应发生。)相容性•例：对于酶促糖改性而言，使用疏水性的，与水不互溶的溶剂是不现实的，因为不溶性底物和不溶性的酶之间无相互作用，必须用亲水性的溶剂（如吡啶或二甲基甲酰胺）(2).溶剂必须对于该主反应是惰性的制剂。•例：酯基转移反应涉及到醇对于酯的亲核攻击而产生另一种酯，如果溶剂也是酯，就会生成以溶剂为基础的酯，如果溶剂是醇，也会得到类似结果。(3)必须考虑的其他因素•溶剂的密度、黏度、表面张力、毒性、废物处理和成本等（溶剂因底物而宜）•溶剂参数lgP：即一种溶剂在辛醇/水两相间分配系数的常用对数值，它能直接反映溶剂的疏水性。生物催化剂的环境调控技术•通过“环境调控”技术，实现生物催化剂活性、选择性的人为控制生物催化剂环境的改变：会导致酶的结构构象的改变进而酶的活性、选择性改变四．PH选择和离子强度的影响•（1）pH选择：•酶在水相的pH值可在有机相中保持.•同一种酶不同来源，对pH值敏感程度大不相同。氧化葡萄糖杆菌催化制备二羟基丙酮(DHA)•二羟基丙酮(DHA)广泛参与诸如聚合、缩合等各种化学反应，是一个重要的