淀粉酶产生菌的筛选、诱变选育及产酶条件优化研究

淀粉酶产生菌的筛选、诱变选育及产酶条件优化研究江西师范大学生命科学学院生物工艺组赵喜华淀粉酶概况淀粉分直链和支链淀粉。淀粉酶是水解淀粉一类酶的统称，能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖。淀粉酶分为α-淀粉酶、淀粉1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）等。主要来源于根霉、曲霉、青霉、芽孢等菌属。淀粉酶的应用实验内容•建立高产淀粉酶产生菌初筛方法•建立高产淀粉酶产生菌复筛方法•建立淀粉酶酶活测定方法•建立高产淀粉酶菌诱变育种方法•建立高产淀粉酶产生菌产酶条件优化方法实验目的•掌握淀粉酶产生菌初筛方法•掌握淀粉酶产生菌复筛方法•掌握淀粉酶酶活测定方法•掌握紫外诱变育种方法•掌握微生物产淀粉酶条件优化方法实验一淀粉酶产生菌的筛选培养基制备配制肉汤培养基45ml，分装于250ml三角瓶中，纱布封口，灭菌。配制初筛平板培养基350ml，分装于500ml三角瓶中，封口膜封口，灭菌。将融化的初筛平板培养基冷却至50-60℃，以无菌操作法倒至已灭菌的培养皿中，至盖满底部。冷却凝固待用。倒平板取5g土样接入45ml肉汤培养基中，30℃摇床振荡15min制成土壤悬液，此时的稀释度为10-1。另取4支试管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度，每支试管内加入9mL无菌水。用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液，加入到10-2试管中混匀，再从此试管中吸取1mL加入到10-3试管中，依此类推直至10-5试管。样品预处理分别从不同稀释度的试管中吸取0.1ml悬液，均匀涂布于初筛培养基平板上，于30℃培养24-48h。涂布初筛平板长出菌落后，挑取不同菌落进行编号保存。将检测试剂（碘液）加入到平板中，涂布均匀，菌落周围形成水解圈的菌株，取水解圈大的菌株进行下一步实验。（本次实验应有照片及水解圈直径表格作为结果）初筛初筛结果菌编号菌落直径（d）透明圈直径（D）D/d值12345678初筛结果保存菌种将得到的菌株转接至斜面培养基上（每组转接2株，每株保存3支），30℃培养48～72h，待菌苔长好后于4℃保存。实验二高产淀粉酶产生菌复筛及酶活测定功能性平板筛选具有简便、快速并节约大量时间等优良特性，但难以得到确切产量水平，只适合初筛。初筛具有不稳定性，有必要进行摇瓶复筛，定量确定表达水平，获得优良性状菌株。高产淀粉酶产生菌的摇瓶复筛•诱导培养基配制可溶性淀粉2g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，水1000ml•接种取斜面，倒入无菌培养基，用无菌接种针打散斜面上的菌苔，再倒回装有无菌培养基（1%葡萄糖代替可溶性淀粉）的三角瓶中进行培养24小时，以10％接种量接种到诱导培养基进行扩大培养48小时。•离心8000r、5min离心发酵液，取上清液。固液转接固液转接固液转接固液转接液液接种液液接种液液接种液液接种（250ml，装液50ml）10%接种量，50ml接5ml30℃培养48h淀粉酶诱导表达葡萄糖标准曲线绘制试管编号1μg/μL葡萄糖标准液体(μL)蒸馏水(μL)DNS(μL)平均OD540110019002000220018002000330017002000440016002000550015002000660014002000DNS法测淀粉酶酶活。将6个试管于沸水中反应10min后迅速冷却，取2mL反应液再加入4mL蒸馏水，通过比色皿于540nm处测定吸光度。以葡萄糖量（μg）为y轴和吸光度为x轴，再采用origin7.5软件获得回归曲线。淀粉酶酶活测定步骤试管A（空白）试管B↓↓加淀粉液含缓冲液1.5mL加淀粉液含缓冲液1.5mL↓↓取2mLDNS加入0.5mL稀释粗酶液↓↓40±0.2℃，30min加入0.5mL稀释粗酶液取2mLDNS↓100℃，10min↓100℃，10min快速冷却，取2.00ml反应液快速冷却，取2.00ml反应液↓↓加入4mL水，于540nm测酶活加入4mL水，于540nm测酶活•1个酶活力单位的定义（1u/ml）：1ml酶液于40℃和pH6.0条件下每分钟产生1微克葡萄糖。菌株编号酶活淀粉酶酶活定义酶活实验数据•酶活力=[OD值代入标准曲线后得到葡萄糖含量(μg)]×稀释倍数÷30min÷0.5mL（本次实验应有酶活数据作为结果）淀粉酶酶活测定获得淀粉酶高产菌•通过摇瓶复筛以及酶活检测，获得产酶最高的菌株。•以此为研究对象，进行紫外诱变选育实验，以期获得产酶更高的突变株。实验三高产淀粉酶产生菌紫外诱变选育•DNA于260nm有最大能量吸收峰，通过与15W紫外灯相距30cm的紫外照射，会吸收大量能量造成DNA分子发生断裂、分子结构形式发生改变。•经过修复，DNA碱基发生了改变从而形成了突变株，有些突变株产酶水平提高了（正突变），而有些突变株产酶水平降低了（负突变），再通过功能性平板筛选和复筛获得目的突变株。•1.培养基：葡萄糖2g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，水1000ml•2.将出发菌株从试管中用25mL无菌生理盐水多次洗出，倒入含有玻璃珠的无菌三角瓶中，进行反复振荡20min。•3.吸出5mL至含有磁针的无菌平皿中，置于磁力搅拌器上，缓慢加速磁力搅拌器。然后打开培养皿盖，再打开紫外灯迅速记时（在红光或黑暗条件下进行）。时间到立刻关闭紫外灯（5S、10S、15S、20S、25S、30S、35S、40S）。•4.⑴对照：将未进行辐射的菌悬液稀释适当倍数10-5，10-6，10-7，涂平皿；•⑵处理组：将进行辐射的菌悬液稀释适当倍数10-3，10-4，10-5，涂平皿。•5.30℃恒温培养48小时（培养物用黑布袋或报纸包裹严实培养）。•6.计数并计算致死率（70%-75%）。产淀粉酶菌株诱变剂量选择致死率计算对照稀释倍数10-510-610-7菌落数辐照稀释倍数10-310-410-5菌落数致死率（对照菌落数－辐照菌落数）/对照菌落数正突变株初筛注意：为了消除培养环境误差，突变株比透明圈大于原始菌比透明圈25%为正突变，小于25%为负突变，在此±25%之间认为是没有发生突变。1.可溶性淀粉2g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，水1000ml2.功能性平板筛选如实验二。比透明圈＝透明圈直径（mm）/菌落直径（mm）正突变株复筛•方法同前，不再重复。•保存5株产酶水平最高的突变株。高产淀粉酶生产菌株的稳定性1.可溶性淀粉2g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，水1000ml2.取斜面，倒入无菌培养基，用无菌接种针打散斜面上的菌苔，再倒回装有无菌培养基的三角瓶中进行培养8小时。8小时后以10％接种量进行扩大培养8小时，依次类推至5代。3.离心发酵液，取上清。4.同前方法测酶活。5.取稳定性和酶活都高的正突变株为研究对象。实验四淀粉酶生产菌产酶条件优化对象：实验三获得的稳定性最好的正突变株。优化方案：培养基组份优化；发酵工艺优化。1、以黄豆粉、玉米粉、可溶性淀粉、酵母膏作为培养基的主要影响因素，每一因素设定3个水平，按表3-1配制培养基（W/V）。另加入Na2HPO40.8%，(NH4)2SO40.4%，NH4Cl0.15%，分装于250ml三角瓶，每瓶50ml，6层纱布封口，灭菌。以测酶活的培养基作为种子培养液，按照10%的接种量接种。实验方法组别因素A黄豆粉因素B玉米粉因素C淀粉因素D酵母膏酶活力/(U/ml)113%11%13%10.4%213%22%25%20.6%313%33%37%30.8%425%11%25%30.8%525%22%37%10.4%625%33%13%20.6%737%11%37%20.6%837%22%13%30.8%937%33%25%10.4%2．接种挑取斜面菌苔5环接入5ml无菌水中，摇匀后用无菌移液管吸取0.5ml菌悬液，接到每一组培养基中。30℃、200r/min摇床培养48h左右。3．酶活测定参照实验二方法，获得最优培养基配方。4.以上面最优培养基为基础，采用单因素优化实验或正交设计实验，获得最佳温度、起始pH和溶氧（转速、装液量、纱布层数），发现最优发酵工艺条件。•大实验结束，清点回收仪器，提交实验报告。谢谢大家！