整理)Co-IP免疫共沉淀样品制备

竹密岂妨流水过蛮鬼2018.11.1山高哪碍野云飞1/3Co-IP免疫共沉淀样品制备一、所需试剂1、Pierce™交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒（货号888054℃保存）（1）Pierce蛋白A/G磁珠1mL，贮存于含有0.05%NaN3的水中，浓度为10mg/mL（2）Pierce免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液（pH7.4）10.025MTris，0.15MNaCl：这个盐浓度可以保持大部分蛋白之间的相互作用20.001MEDTA:乙二胺四乙酸，螯合金属离子，抑制一些含巯基的酶31%NP40：表面活性剂，可以温和裂解膜，拮抗非特异性的蛋白相互作用45%甘油:其粘性可以保护蛋白质之间的相互作用起（3）20×交联缓冲液，25mL,稀释后含10mM磷酸钠，150mMNaCl；pH7.2（4）DSS（辛二酸二琥珀酰亚胺酯，具有胺反应性的同源双功能交联剂，具体见附/1），No-Weigh™形式，每包加217μDMSO溶解成10X储存液（4）中和液，1.0mL，pH8.5（5）洗脱液，25mL，pH2.0（如需自己配见附录2）（6）电泳上样缓冲液：非还原性，（5×）,5mL，pH6.8，0.3MTris·HCl，5%SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料（好像不含巯基乙醇，减少IP抗体的变性）2、Proteasecocktail（货号：cw2200s）：蛋白酶抑制剂混合物，具体什么就不管了3、IP抗体和IB抗体（两者抗体种属最好不一样！理由见附录3），对照IgG抗体4、ddH2O二、具体步骤（冰上进行）第一天：一蛋白样品制备一般用超大皿来提蛋白，裂解蛋白只需10-15min，裂解蛋白离心期间可以进行第二和第三一部分二抗体—A/G蛋白磁珠结合1、1×改良的交联缓冲液制备：0.1mL的20×交联缓冲液+0.1mL的免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液+1.8mL超纯水2、向离心管中加入25μL磁珠（使用前涡旋），将离心管置于磁力架上1分钟，收集磁珠。去除存储液3、预处理磁珠：加入1×改良的交联缓冲液500μL。轻柔混匀，室温下，在旋转器上孵育1分钟。通过磁力架收集磁珠，去除上清。重复此步骤一次。（作用见附录4）4、1:20稀释抗体（包括IP抗体和IgG抗体）：5μg抗体+5μL20×交联缓冲液+5μL的免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液+85μl超纯水=100μL。（抗体量自行调整）5、3+4轻柔混匀，室温下，在旋转器上孵育15分钟。孵育过程中，每5-10分钟轻微涡旋磁珠，使磁珠处于悬浮状态。6、用磁力架收集磁珠。去除上清。7、加入100μL的1×改良偶联缓冲液，轻微涡旋或颠倒混匀。用磁力架收集磁珠。去除上清。8、加入300μL的1×改良偶联缓冲液，轻微涡旋或颠倒混匀。用磁力架收集磁珠。去除上清。重复此步骤一次。三抗体—A/G蛋白磁珠交联1、DSS交联剂储存液制备：用移液枪头刺穿一管DSS的铝袋，加入217μL的DMSO，制成竹密岂妨流水过蛮鬼2018.11.1山高哪碍野云飞2/3100×的储液(25mM)。彻底混合溶液。2、DSS工作液制备：将DSS以1:100稀释于DMSO3、向二中磁中加入2.5μL的20×偶联缓冲液+4μL的0.25mMDSS+43.5μL的超纯水（或者加5μL的20×偶联缓冲液+8μL的0.25mMDSS+87μL的超纯水共100ul）4、室温下，用旋转器或搅拌器孵育交联反应30分钟。孵育过程中，每5-10分钟轻微涡旋磁珠，使磁珠处于悬浮状态。（做到这一步可进行刮蛋白）5、用磁力架收集磁珠。移出并保留液体以确证抗体交联。6、向磁珠中加入100μL洗脱缓冲液，并室温下，在旋转器上轻柔混匀5分钟，以去除未交联的抗体并终止交联反应。用磁力架收集磁珠，去除上清。7、向磁珠中加入100μL洗脱缓冲液，轻微涡旋或颠倒混匀。用磁力架收集磁珠，去除上清。重复一次。8、向磁珠中加入200μL预冷的免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液，轻微涡旋或颠倒混匀。用磁力架收集磁珠，去除上清。重复一次。9、4℃保存抗体交联磁珠或进行下一步四蛋白样品（抗原）-抗体-磁珠免疫共沉淀1、将500μL蛋白样品加入含有抗体交联磁珠的离心管中。4℃旋转过夜第二天1、用磁力架收集磁珠，除去未结合的样品，保存以备分析。2、向离心管中加入500μL免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液，轻柔混匀。收集磁珠，弃上清。重复此操作一次。3、向管中加入500μL超纯水，轻柔混匀。用磁力架收集磁珠，弃上清。4、抗原洗脱：向离心管中加入100μL洗脱液。旋转混匀，室温下，在旋转仪或混合器上孵育离心管5分钟。通过磁力分离磁珠，保留含有目的抗原的上清。5、洗脱后，在每100μL洗脱液中加入10μL中和液来中和低pH。为获得更多的抗原，可以重复洗脱一次。三、注意事项1、DSS（辛二酸二琥珀酰亚胺酯）：具有胺反应性的同源双功能交联剂。通常通过缓冲到pH7.5(6.5-8.5)的酰胺键连接到含伯胺的分子上。包含8个原子的连接基。保存：-20℃2、各种液体配方：（1）免疫沉淀缓冲液：20mM磷酸钠,pH7.5,500mMNaCl,0.1%SDS,1%NP40,0.5%脱氧胆酸钠and0.02%叠氮化钠.（NOTE:50mM醋酸钠缓冲液,pH5.0,.500mMNaCl,0.1%SDS,1%NP-40and0.02%叠氮化钠也可作为免疫沉淀的缓冲液，能提高蛋白G的结合功效）（2）洗脱液：0.1M甘氨酸-HClbuffer,pH2.5（3）SDS-PAGE上样缓冲液(pH6.8)：2%SDS,62.5mMTris碱,10%甘油,2-5%2-巯基乙醇,3、IP抗体和IB抗体两者抗体种属最好不一样！：由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加ProteinA/Gbeads与样品孵育，因此在最后离心获得抗体-agarosebeads复合物后，eppendorf管中主要含有抗体，目的蛋白，ProteinA/Gbeads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中，抗体和目的蛋白以及ProteinA/Gbeads三者之间竹密岂妨流水过蛮鬼2018.11.1山高哪碍野云飞3/3是以非共价健结合在一起，只有ProteinA/G与agarosebeads是共价结合在一起的。因此，最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去ProteinA/Gbeads后，eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此，WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外，如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话，还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug)，所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时，重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。针对上述情况，通常有二种解决办法：a．选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验，这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验，就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。b．使用交联剂将抗体和ProteinA/Gbeads交联，然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarosebeads复合物，最后离心去除抗体-agarosebeads复合物，上清中只留下目的蛋白。（该试剂盒用的就是第二种方法）4、抗体用量选择：一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1ug抗体，最高可以添加至5ug抗体，过多的抗体会产生假阳性。