酵母双杂交原理介绍

酵母双杂交技术酵母双杂交技术¾酵母双杂交系统(two-hybridsystem)也叫相互作用陷阱(interactiontrap)，是1989年由Song和Field基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统建立的。¾酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法，在蛋白质相互作用的研究方面得到了广泛的应用并取得了许多有价值的重要发现。在此基础上又发展了反向双杂交，三杂交及核外双杂交等多项技术。StanleyField酵母双杂交原理介绍ƒ酵母中，半乳糖代谢所需的基因被两个调节蛋白所控制：GAL4，GAL80ƒ当存在半乳糖时，GAL4蛋白与UAS上游的基因中的GAL4效应元件结合，激活转录。ƒ不存在半乳糖时，GAL80结合GAL4阻碍转录激活。2.酵母双杂交原理介绍ƒ完整的酵母转录因子GAl4分为结构上可以分开的、功能上又相互独立的2个结构域。ƒ一个是位于N端1-174位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNAbindingdomain,DNA-BD）。ƒ另一个是位于C端768～881位氨基酸残基区段的转录激活域（Activationdomain，AD）。酵母双杂交技术原理ƒ很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-bindingdomain，BD）与转录激活域（Transcriptionalactivationdomain，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。酵母双杂交系统组成酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)；(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)；(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和绿色荧光蛋白等酵母双杂交原理介绍ƒ一个酵母双杂交系统包括3个部分：ƒ带有1个或多个报告基因的宿主菌株；ƒ与GAL4-BD融合表达蛋白，被表达的蛋白称为旅馆诱饵蛋白（bait）；ƒGAL4-AD融合表达载体，被表达的蛋自称为靶蛋白（prey）。2.酵母双杂交原理介绍ƒ将可能存在相互作用的2种蛋白质，即已知蛋白X和待研究蛋白Y，分别作为诱饵(bait)和猎物(prey)，并分别和BD／AD在空间结构上重新连接为一个整体而与报告基因的上游激活序列(UAS)结合ƒ如果X和Y之间可以形成蛋白-蛋白复合物，使GAlA2个结构域AD和BD相互接近，表现出转录因子的活性从而启动转录，使UAS下游启动子调控的报告基因得以表达。ƒ反之，如果诱饵和猎物之间不存在相互作用，BD与AD就不能结合，报告基因则不能被启动表达。2.酵母双杂交原理介绍3.酵母双杂交的应用ƒ发现新的蛋白质和蛋白质的新功能ƒ在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用ƒ筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响ƒ建立基因组蛋白连锁图（GenomeProteinLinkageMap）