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生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程本规程适用于人用生物制品生产用动物细胞基质及检定用动物细胞，包括具有细胞库体系的细胞及原代细胞。细胞基质系指可用于生物制品生产的所有动物或人源的连续传代细胞系、二倍体细胞株及原代细胞。生产非重组制品所用的细胞基质，系指来源于未经修饰的用于制备其主细胞库的细胞系/株和原代细胞。生产重组制品的细胞基质，系指含所需序列的、从单个前体细胞克隆的转染细胞。生产杂交瘤制品的细胞基质，系指通过亲本骨髓瘤细胞系与另一亲本细胞融合的杂交瘤细胞系。一、对生产用细胞基质总的要求用于生物制品生产的细胞系/株均须通过全面检定，须具有如下相应资料，并经国务院药品监督管理部门批准。（一）细胞系/株历史资料1.细胞系/株来源资料应具有细胞系/株来源的相关资料，如细胞系/株制备机构的名称，细胞系/株来源的种属、年龄、性别和健康状况的资料。这些资料最好从细胞来源实验室获得，也可引用正式发表文献。人源细胞系/株须具有细胞系/株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及健康状况及病原体检测结果的相关资料。动物来源的细胞系/株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、地域来源、年龄、性别、供体的一般健康状况及病原体检测结果的相关资料。如采用已建株的细胞系/株，应具有细胞来源的证明资料。应从能够提供初始细胞历史及其溯源性书面证明材料的机构获得，且应提供该细胞在该机构的详细传代记录，包括培养过程中所使用的所有原材料的详细信息，如种类、来源、批号、生产日期及有效期、制备或使用方法、质量标准及检测结果等。2．细胞系/株培养历史的资料应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及建立细胞系/株过程的相关资料，包括所使用的物理、化学或生物学手段，外源插入序列，筛选细胞所进行的任何遗传操作或筛选方法、在动物体内传代过程以及细胞生长特征、培养液成分等。同时还应具有细胞鉴别、内源及外源因子检查结果的相关资料。应提供细胞传代历史过程中所用的细胞培养液的详细成分并应具有朔源性。如使用人或动物源性成分，如血清、胰蛋白酶、乳蛋白水解物或其他生物学活性的物质，应具有这些成分的来源、批号、制备方法、质量控制、检测结果和质量保证的相关资料。（二）细胞培养操作要求细胞取材、建库及制备全过程应具有可溯源性及操作的一致性、并对各个环节的风险进行充分的评估。1．细胞来源供体所有类型细胞的供体应无传染性疾病或未知病原的疾病。神经系统来源的细胞不得用于疫苗生产。2．原材料的选择与细胞培养相关的所有材料，特别是人源或动物源性材料，应按照本版药典的相关要求进行风险评估，选择与生产相适应的原材料，必要时进行检测。所有生物源性材料均应无细菌、真菌、分枝杆菌、支原体及病毒等外源因子污染。细胞培养过程中所用的牛血清及胰酶应符合本版药典的相关要求。细胞培养液中不得含有人血清。如果使用人血白蛋白，应使用获得国家药品管理当局批准的人用药品。用于生物制品细胞制备过程中不得使用青霉素或β-内酰胺(β-Lactam)类抗生素。配制各种溶液的化学药品应符合《中国药典》（二部）或其他相关国家标准的要求。3．细胞培养体系：应控制对细胞生长有重大影响的关键的已知可变因素，包括规定细胞培养液及其添加成分的化学组成及纯度，记录所有制备的培养用试剂并通过检定放行，规定细胞培养的理化参数（如pH、温度、湿度、气体组成等））的变化范围并进行监测，以保证细胞培养条件的稳定性。4．细胞收获及传代应结合生产工艺的特性，尽可能减少对细胞的操作。细胞收获及传代应采用可重复的方式,以保证收获时细胞的汇合率、孵育时间、温度、离心速度、离心时间以及传代后活细胞接种密度具有一致性。传代细胞的体外细胞龄可采用细胞群体倍增水平或传代水平计算。二倍体细胞的细胞龄通常以群体倍增水平计算，也可以每个培养容器细胞群体细胞数为基础，每增加一倍作为一世代粗略估算，即一瓶细胞传二瓶(1:2分种率)，再长满瓶为一世代；一瓶传四瓶(1:4)为二世代；一瓶传八瓶(1:8)则为三世代。生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的前2/3内。连续传代细胞系的细胞龄可以群体倍增水平计算，也可以按照固定的传代比率进行传代，每传一次视为一代。5．细胞系建立如对细胞进行了对其特性有重要影响的操作，如具有了成瘤性，进行了细胞克隆及遗传修饰等，这种细胞则应被视为一个新（或不同的）细胞系，应在原细胞名称后增加后缀或编号重新命名，并重新建立主细胞库。在细胞克隆过程中，应选择单个细胞用于扩增，详细记录克隆过程，并根据整合的重组DNA的稳定性、细胞基因组及表型的稳定性、生长速率、目的产物表达水平和完整性及稳定性，筛选具有分泌目的蛋白最佳特性的候选克隆,可用于建立细胞种子。6．细胞冻存细胞应在大多数细胞处于对数生长期时进行冻存。应采用符合细胞培养物的最佳冻存方法；在每一次冻存时均应采用相同的降温过程，并记录每一次的冻存过程。每一个细胞库冻存时，应将同一次扩增的处于相同倍增水平的细胞培养物合并，并在分装前混合均匀。每支冻存管中的细胞数应足以保证细胞复苏后可获得有代表性的培养物。对于一个新的细胞库，除早代培养物在组织采集时或重组细胞筛选可能需要使用抗菌素外，细胞建库培养时不应使用抗菌素。7．人员生产人员应定期检查身体，已知患有传染性疾病的人员也不能进行细胞培养。在生产区内不得进行非生产制品用细胞或微生物的操作；在同一工作日进行细胞培养前，不得接触动物或操作有感染性的微生物（三）细胞库细胞库的建立可为生物制品的生产提供检定合格、质量相同、能持续稳定传代的细胞。细胞建库应在符合现行药品生产质量管理规范（GMP）的条件下制备。1．细胞库建立细胞库为三级管理，即细胞种子、主细胞库及工作细胞库。。在某些特殊情况下，也可采用细胞种子及MCB二级管理，但须得到国务院药品监督管理部门的批准。（1）细胞种子（Cellseed）由一个原始细胞群体发展成传代稳定的细胞群体，或经过克隆培养而形成的均一细胞群体，通过检定证明适用于生物制品生产或检定。在特定条件下，将一定数量、成分均一的细胞悬液，定量均匀分装于于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管，于液氮或-130℃以下冻存，即为细胞种子，供建立主细胞库用。对于引进细胞，生产者获得细胞后，冻存少量细胞，经过验证可用于生物制品生产，此细胞可作为细胞种子，供建立主细胞库用。（2）主细胞库(MCB)取细胞种子通过规定的方式进行传代、增殖后在特定倍增水平或传代水平同次均匀混合成一批，定量分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或-130℃以下，经全面检定合格后，即可作为主细胞库，用于工作细胞库的制备，生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次。（3）工作细胞库(WCB)工作细胞库的细胞由MCB细胞传代扩增制成。由MCB的细胞经传代增殖，达到定代次水平的细胞，合并后制成一批均质细胞悬液，定量分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或-130℃以下备用，即为工作细胞库。生产企业的工作细胞库必须限定为一个细胞代次。冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批制品。复苏后细胞的传代水平应不超过批准用于生产的最高限定代次。所制备的WCB必须经检定合格（见本规程‘细胞检定’中有关规定）后，方可用于生产。2．细胞库的管理主细胞库和工作细胞库应分别存放。每一个库应在生产设施内至少2个不同的地点或区域存放。应监测并维护细胞库冻存容器以保证细胞库贮存在一个高度稳定的环境中。非生产用细胞应与生产用细胞严格分开存放。每种细胞库均应分别建立台帐，详细记录放置位置、容器编号、分装及冻存数量，取用记录等。细胞库中的每支细胞均应具有细胞系/株名、代次、批号、编号、冻存日期，贮存容器的编号等信息。为保证细胞冻存后仍具有良好的活力，冻存前的细胞活力应不低于90%，冻存后应取一定量的可代表冻存全过程的冻存管复苏细胞，复苏后细胞的活力应不低于80%。二倍体细胞冻存后，应至少作一次复苏培养并连续传代至衰老期，检查不同传代水平的细胞生长情况。细胞冻存后，可通过定期复苏细胞及复苏后细胞的活力数据验证细胞在冻存及贮存条件下的稳定性。（四）细胞检定细胞检定主要包括以下几个方面：细胞鉴别、外源因子和内源因子的检查、成瘤性/致瘤性检查等。必要时还须进行细胞生长特性、细胞染色体检查、均一性及稳定性检查。这些检测内容对于MCB细胞和WCB细胞及生产限定代次细胞均适用。细胞检定的基本要求见下表1。细胞库建立后应至少对MCB细胞及生产终末细胞进行一次全面检定。当生产工艺发生改变时，应重新对EOPC进行检测。每次从MCB建立一个新的WCB，均应按规定项目进行检定。表1、细胞检定项目要求①生产终末细胞:是指在或超过生产末期时收获的细胞，尽可能取按生产规模制备的生产末期细胞。检测项目MCBWCB生产终末细胞（EOPC）①细胞鉴别++（+）细菌、真菌检查+++分枝杆菌检查（+）（+）（+）支原体检查+++内、外源病毒污染检查体外不同细胞接种培养法+++动物和鸡胚体内接种法+-+逆转录病毒检查+-+种属特异性病毒检查（+）--牛源性病毒检查（+）（+）（+）猪源性病毒检查（+）（+）（+）其它特定病毒检查（+）（+）-染色体检查（+）（+）（+）成瘤性检查+-（+）致瘤性检查--（+）“+”为必检项目，“-”为非强制检定项目。（+）需要根据细胞特性、传代历史、培养过程等情况要求的检定项目。1．细胞鉴别试验新建细胞系/株、细胞库(MCB和WCB)和生产终末细胞应进行鉴别试验，以确认为本细胞，且无其他细胞的交叉污染。细胞鉴别试验方法有多种，包括细胞形态、生物化学法(如同工酶试验)、免疫学检测(如组织相容性抗原、种特异性免疫血清)、细胞遗传学检测(如染色体核型、标记染色体检测)、遗传标志检测(如DNA指纹图谱,包括短串联重复序列（STR）、限制片段长度多态性（RFLP-PCR）以及内含子多态性（EPIC-PCR）法等)以及其它方法（如杂交法、PCR法、报告基因法等）。应至少选择上述一种或几种方法对细胞进行种属和细胞株间及专属特性的鉴别。2．细菌、真菌无菌检查取混合细胞培养上清液或冻存细胞管样品，依法检查（附录XIIA），应符合规定。对于MCB及WCB培养物，至少取混合细胞培养上清液10毫升，尽可能采用薄膜过滤法检测。对于冻存细胞，至少取冻存细胞总量的1%或至少2支冻存细胞管，可采用直接接种法检测。3、分枝杆菌检查取至少107个活细胞用培养上清制备细胞裂解物，按照无菌检查法（附录XXX）进行分枝杆菌检查。取细胞裂解物接种于适宜的固体培养基（如罗氏培养基（LöwensteinJensenmedium）或Middlebrook7H10培养基），每个培养基接种1mL并做3个重复。并同时以草分枝杆菌做为阳性对照。将接种后的培养基置于37℃培养56天，阳性对照应有菌生长，接种供试品的培养基未见分枝杆菌生长，则判为合格。用于外源病毒检测的豚鼠接种法也可检测分枝杆菌，豚鼠法也可用于分枝杆菌检测，按表2所列方法进行试验和观察。豚鼠在注射前应观察4周，结核菌素试验为阴性者方可用于试验，观察期末应进行结核菌素试验，并剖检观察主要脏器是否有节结形成。结核菌素试验为阴性，主要脏器无结节，为则符合要求。分枝杆菌检查也可采用经过验证的分支杆菌核酸检测法替代培养法。4．支原体检查取细胞培养上清液样品，依法检查（附录XIIB），应符合规定。5．细胞内、外源病毒因子检查应注意检查细胞系/株中是否有来源物种中潜在的可传染的病毒，以及由于使用的原材料或操作带入的外源性病毒。细胞进行病毒检查的种类及方法，须根据细胞的种属来源、组织来源、细胞特性、传代历史、培养方法及过程等确定。如MCB进行了全面检定，WCB需检测的外源病毒种类可主要考虑从MCB到WCB过程中可能引入的病毒，而仅存在于建MCB前的病毒可不再重复检测。5.1细胞形态观察及血吸附试验取混合瓶细胞样品，接种至少6个细胞培养瓶或培养皿，待细胞长成单层或至一定数量后换维持液，持续培养两周。如有必要,可以适当换液。逐日镜检细胞，细胞应保持正常形态特征。如为贴壁细胞或半贴