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Cas9介导的斑马鱼基因组定点突变实验方法与流程2013-02-16v1.1北京大学生命科学学院斑马鱼功能基因组实验室 1ABriefProtocolforGeneTargetingbyCas9inZebrafish（2013-02-16v1.1）一、Cas9靶位点的选择1.Cas9靶位点（靶点）包含20个碱基，其中5’端应为GG▲；紧邻靶点3’端的3个碱基构成PAM区，要求序列为NGG（N为任意碱基）（图1）。可在正义链或反义链上选择靶位点。可参考如下的Cas9靶位点预测网站：▲注意：5’端选择GG并非Cas9靶点本身的要求，而是由于本实验所用的gRNA（guideRNA）体外转录载体采用了T7启动子。T7启动子要求转录起始位点的前两位为GG，并且第三位最好为G或A；如果采用其他的启动子，可以随之更改。图1.Cas9的作用原理（引自Malietal.,2013）2．如果采用限制性内切酶酶切法检测靶点的突变效率，则需要在靶点序列内、PAM的5’端附近选择一个单一的限制性内切酶位点。例：斑马鱼th基因的某个Cas9靶点（此例的靶点位于反义链上）：BxtYI5’-TCTTGTCACCAAATATGATCCGGATCTGGATCAGGATCACCCAgtaagtgctggattat-3’3’-AGAACAGTGGTTTATACTAGGCCTAGACCTAGTCCTAGTGGGTcattcacgacctaata-5’PAMTargetsite3．对于codinggene，靶位点尽量选择在基因CDS的前2/3区域并且在ATG之后，但是不要在昀后一个exon上；昀好能破坏重要的domain和/或所有的isoform/variant。同时还要考虑避免在第一个起始密码子的下游还存在额外的具有相同阅读框（in-frame）的起始密码子。靶点也可选择在intron和exon交界处，以破坏基因的剪接。原则上不要选择5’-UTR和3’-UTR。Cas9介导的斑马鱼基因组定点突变实验方法与流程2013-02-16v1.1北京大学生命科学学院斑马鱼功能基因组实验室 2二、Cas9靶位点的确认1.确认靶点在基因组中的唯一性：靶位点序列在Ensembl网站进行blast，确认是斑马鱼基因组中的单一位点。2．PCR扩增靶点序列：从准备用于打靶的成鱼中PCR扩增靶点及附近的序列。在靶位点周围设计引物，使其距离靶位点两侧都大于100bp，并且PCR扩增产物昀好不要超过500bp，且为单一条带。3．检测酶切效率：如果计划采用酶切法检测靶点的突变情况，则需要对上述PCR产物进行酶切验证。要求尽量酶切完全，并且电泳后能明显与原条带区分开。4．测序确认靶点序列：将PCR产物直接送去测序（不需要TA克隆）。如果实测序列跟靶点的预测序列有出入，原则上应根据实测结果设计gRNA序列；但是，如果实测序列不再符合靶点选择的原则（例如，PAM区不是NGG，或5’端不是GG），则应重新选择靶点；如果测序结果显示靶点序列为杂合子，则昀好重新选择实验材料。5．遴选实验材料：采用上述的PCR与测序策略筛选出足够量的靶点正确且为纯合的成鱼，后续针对该靶点的实验昀好都用这一批成鱼进行。三、构建gRNA体外转录载体1.p-T7-gRNA为gRNA的克隆与体外转录载体，载体骨架来自pMD18-Tsimple（Amp抗性），gRNA序列的连入方向为RV-M-T7-M13-47。主要区域的序列如下：T7promoter+1BbsIBbsI5’-…GAATTCTAATACGACTCACTATAGcaGTCTTCTAGAAGACgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttAAAGCTT…-3’2．用BbsI酶切pT7-gRNA、切胶回收，得到gRNA克隆骨架pT7-gRNA_BbsI，所得粘性末端如下所示（骨架上5’各留下一个4bp的overhang，中间的小片段丢弃）：5’-…TAATACGACTCACTATAGcaGTCTTCTAGAAGACgttttagagctag…-3’3’-…ATTATGCTGAGTGATATCGTCAGAAGATCTTCTGcaaaatctcgatc…-5’酶切体系：pT7-gRNAplasmid1~2μgBufferG2.0μLBbsI(Fermentas)0.5μLddH2OTo20μL37℃，4h;切胶回收，20μLddH2O溶解。3．根据靶位点订购两条oligo（均为25nt，s序列与靶序列同向，As反向）。以th为例：thtargetoligos：5’-ataGGGTGATCCTGATCCAGATCgt-3’thtargetoligoAs：5’-taaaacGATCTGGATCAGGATCACC-3’Cas9介导的斑马鱼基因组定点突变实验方法与流程2013-02-16v1.1北京大学生命科学学院斑马鱼功能基因组实验室 3方框内为靶点序列。红色碱基为形成粘性末端所必需的固定序列，不能更改；蓝色碱基则需要根据靶点序列更改（注意targetoligoAs中蓝色的碱基为靶点的互补序列，只需要其中的19个碱基，昀后一个G不需要合成）。4．用ddH2O分别将oligo溶解为10μM的溶液，退火，得到粘性末端如下的小片段：thtarget_an：5’-ataGGGTGATCCTGATCCAGATCgt-3’3’-CCACTAGGACTAGGTCTAGcaaaat-5’退火程序：oligos(10μM)5μLoligoAs(10μM)5μL95℃5min,-1℃/30sec/cycle,to4℃5．将退火后的片段与回收的上述gRNA克隆骨架pT7-gRNA_BbsI连接、转化，挑取克隆，用RV-M与targetoligoAs作为引物进行菌液PCR鉴定（58℃退火，延伸30sec，30cycle）。目的条带约为130bp。挑取阳性克隆送测序，选取序列正确的克隆甘油保菌、提质粒。RV-M序列：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’连接体系：pT7-gRNA_BbsI0.5μLtarget_an2.0μL2*solutionI(Takara)2.5μL16℃，2h以th靶位点为例，正确的克隆序列如下（相应的载体称为pT7-thgRNA）：5’-…GAATTCTAATACGACTCACTATAGGGTGATCCTGATCCAGATCgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttAAAGCTT…-3’四、制备Cas9mRNA和gRNA1．制备Cas9mRNA：（1）制备Cas9mRNA的体外转录模板：通过XbaI单酶切线性化pSP6-2sNLS-spCas9载体（Amp抗性）（37℃，4h以上）；取少量电泳确认线性化完全后，直接回收线性化产物。（2）体外转录Cas9mRNA。mRNA体外转录体系（SP6mMESSAGEmMACHINE®Kit，Ambion）：2×NTP/CAP10μL10×ReactionBuffer2μLLinearizedtemplateDNA1μg(6μL)37℃，2h；加入1μL TURBODNase，37℃、15min以去除DNA模板；Cas9介导的斑马鱼基因组定点突变实验方法与流程2013-02-16v1.1北京大学生命科学学院斑马鱼功能基因组实验室 4SP6EnzymeMix2μLDEPCH2OTo20μL取0.3μL，电泳查看转录效果（1%agarose，产物约2Kbp）；回收mRNA。（3）添加polyA序列、回收得到可用于显微注射的Cas9mRNA（添加polyA序列可增强mRNA的稳定性和翻译效率）。mRNA加polyA的反应体系：（这里选用的是NEB的加A体系；也可以使用Ambion的加A试剂盒）ATP(10mM)5μL10×ReactionBuffer5μL体外转录、回收的mRNAE.coliPoly(A)聚合酶1μLDEPCH2OTo50μL37℃，1h；取0.3μL，电泳查看加A效果；（1%agarose，产物约2Kbp，比加A前略大）；回收mRNA。2．制备gRNA：（1）制备gRNA的PCR体外转录模板：用T7-crfwd和tracrrev引物对，以构建好的gRNA体外转录载体（例如pT7-thgRNA质粒）为模板，使用高保真酶PCR，得到gRNA体外转录模板（58℃退火，延伸30sec，40cycle，40μL体系）。取1μLPCR产物电泳，确认为单一条带（125bp）后直接回收PCR产物，用于后续的步骤。T7-crfwd序列：5’-GAAATTAATACGACTCACTATA-3’tracrrev序列：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’（2）体外转录gRNA。gRNA体外转录体系：（这里选用的是Ambion的MAXIscript®T7Kit；也可以使用其它的体外转录体系，例如Promega的产品，但是不要用体外转录mRNA的体系。） 2.5mmol/LNTP4μL10×ReactionBuffer2μLTemplateDNA1μg(6μL)T7EnzymeMix2μLDEPCH2OTo20μL37℃，1h；加入1μL TURBODNase，37℃、15min以去除DNA模板；取0.3μL，电泳查看转录效果（3%agarose，产物100bp左右）；回收gRNA。（3）回收gRNA：建议使用Ambion的mirVana™miRNAIsolationKit进行回收。也可采用LiCl沉淀法，但效率较低。用mirVana™miRNAIsolationKit回收小片段RNA：1）用RNase-freewater将gRNA转录体系稀释到300μL，加入330μL无水乙醇；2）将溶液加到回收柱中，10000g离心15s（转速太高会损伤滤膜）；3）加入700μL的miRNAWashSolutionI，离心5~10s；4）加入500μL的WashSolutionII，离心5~10s；重复一次；Cas9介导的斑马鱼基因组定点突变实验方法与流程2013-02-16v1.1北京大学生命科学学院斑马鱼功能基因组实验室 55）弃去收集管中的液体，离心1min，去除残余的液体；6）加入适量95℃预热的RNase-freewater或ElutionSolution，最大转速离心20~30s，收集得到gRNA溶液。五、制备F0斑马鱼与靶点突变效率检测1．将Cas9mRNA和gRNA混和，注射到单细胞期斑马鱼胚胎中（每个靶点建议至少注射200枚胚胎）。同时留一些未注射的同批胚胎作为对照。可尝试不同的注射量，推荐剂量为Cas9mRNA300~500pg，gRNA25~200pg。2．取2~4dpf注射后表型正常的胚胎（30枚，5枚/管），提取基因组DNA，PCR、酶切检测靶位点突变效率。未切开的PCR条带占所有条带的荧光亮度的百分比可大致反映该靶点的突变效率。也可以选用直接克隆测序等其他方法代替酶切检测突变效率。例：BstYI酶切检测th位点的突变效率（图2）：图2.thCas9靶点酶切鉴定结果箭头所指为酶切位点被破坏的潜在突变条带。此例的靶点突变效率约为20％。一种提取基因组DNA的简易方法（仅适用于基因组DNA的短片段PCR）：1）将1~5个胚胎去膜后转移到PCR管中；2）根据胚胎数加入适量的50mmol/LNaOH（每个胚胎10μL左右）；3）PCR仪加热裂解胚胎，程序：95℃10min，4℃forever；取出后Vortex振荡均匀；加入1/10体积1mol/LTris（pH8.0）中和NaOH，混匀。3．将未切开的条带回收、TA克隆测序，检测突变类型