分析方法在药物代谢动力学中的应用

分析方法在药物代谢动力学中的应用黄维玲(佳木斯大学药学院)摘要:近年来随着科学技术水平的不断提高，药物的分析方法不断得到改善。本文简要介绍了几种分析方法在药物代谢动力学中的应用。包括色谱分析法、质谱分析法、光谱分析法及联用技术分析法。关键词:分析方法；药物代谢动力学；高效液相；联用分析方法药物代谢动力学（pharmacokinetics，PK）是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄（ADME）随时间变化过程及规律的一门学科。【1】它是应用数学处理方法，定量描述药物及其他外源性物质在体内的动态变化规律，研究机体对药物的处置以及所产生的药理学和毒理学意义，并且探讨药物代谢转化途径，确定代谢产物结构，研究代谢产物的药效或毒性的物质基础，弄清药物疗效和毒性与药物浓度的关系。【2】药物代谢动力学的地位越来越重要，分析方法也应运而生。药物分析通过分析手段了解药物在体内数量与质量的变化，获得药动学的各种参数和转变、代谢方式、途径等信息，有助于从生产、研究、临床使用等方面对药物作出估计与评价，从而改进和发展。【3】1色谱分析法1.1顶空气相色谱法顶空气相色谱法(HS-GC)又称液上气相色谱分析，是一种联合操作技术。通常采用进样针在一定条件下一定温度下对固体、液体、气体等进行萃取吸附，然后在气相色谱分析仪上进行脱附注射。萃取过程常在固相微萃取平台上进行。主要分为静态顶空分析、动态顶空分析、顶空-固相微萃取三类。顶空技术的使用，可以免除冗长烦琐的样品前处理过程，避免有机溶剂带入的杂质对分析造成干扰，减少对色谱柱及进样口的污染；顶空色谱技术以其简单实用的优点在环境检测（如饮用水中挥发性卤代烃和工业污水中挥发性有机物）、药物中有机残留溶剂检测、食品、法庭科学、石油化工、包装材料、涂料及酿酒业分析等领域得到广泛的应用。例如，邹黎【4】就利用了顶空气相色谱内标法测定血液中乙醇含量。结果得出了顶空气相色谱内标法直接顶空进样，不受进样误差干扰，结果稳定，操作方便，分析时间短、线性关系良好、灵敏度高，适用于全血中乙醇含量的测定。1.2高效液相色谱法高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。HPLC的特点是三高一广一快，即高压、高效、高灵敏度，应用范围广，分析速度快。如朱军【5】等利用高效液相色谱法测定房水样品中伊曲康唑药物的分析方法,并且对眼内药物的药代动力学进行了研究。文献报道使用乙晴-水(675:325)为流动相,而他们采用甲醇-0.5%醋酸铵-乙醚为流动相进行分析,实验表明检测下限和相对误差均较低，本法用于滴眼液制剂中伊曲康唑含量的测定,结果准确可靠,符合配制含量。为尽可能减少基体的干扰,简化操作和提高检测灵敏度,将房水样品采用氢氧化铵固定后,加乙酸乙酯振荡提取有机层,吹干后加流动相振荡溶解的方法提取药物,回归曲线同法操作,回收实验证实方法可靠,平均回收率为(97.2±4.7)%，无系统误差。相对文献的1ml血清用量及5ml提取液,本法0.2ml样本及0.2ml有机相提取则大大减少了标本量和简化了液-液提取操作,用微型离心管即可完成全部操作,减小了试剂毒性。张家良【6】等利用高压液相色谱法测定血液中氟呱吮醇含量采用反相色谱,以国产填料YWG—C18为色谱柱固定相,用二苯胺为内标物,测定氟呱啶醇血药浓度,并与放射免疫法进行了比较，结果接近一致。本法为临床检测患者血药浓度提供了一个快速,简便而灵敏的分析测定方法。张瑞【7】等利用了高效液相色谱法测定大鼠血浆中白藜芦醇含量及其药物代谢动力学，此法建立高效液相色谱法测定大鼠血浆中白藜芦醇浓度,并研究大鼠静脉注射白藜芦醇后的药物代谢动力学。得出了HPLC灵敏度高,操作简便﹑准确,可用于大鼠血浆中白藜芦醇的测定及药物代谢动力学研究。1.3反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法（reversedphasehighperformanceliquidchromatographyRP-HPLC）由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系（正相色谱）相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基键合硅胶，典型的流动相是甲醇和乙腈。RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离。卫洪清【8】利用了反相高效液相色谱法同时测定4种苯二氮卓类药物。以ODSHypersil为色谱柱，甲醇-水(51:49;V/V,用氨水调pH7.8)为流动相，流速为0.8mL/min,柱温为45℃，检测波长为220nm的最佳色谱条件。甲苯作为内标物，以内标法峰面积定量。硝西泮，地西泮，三唑仑和艾司唑仑线性范围分别是0.1mg/L～320mg/L,0.2mg/L～320mg/L,0.1mg/L～320mg/L和0.08mg/L～320mg/L；检测限分别为0.1mg/L，0.2mg/L，0.1mg/L和0.08mg/L。该方法用于尿液中的苯二氮卓类药物的测定。其回收率为97.0%～108.7%,标准偏差为1.7%～3.0%(n=7)。该方法简单、快速、精确、灵敏、重复性好。刘广兴【9】等也利用了反相高效液相色谱法测定了大鼠血浆中的阿仑膦酸钠药物的浓度。该分析方法检出限低,能够检测纳克级血浆内药物浓度，线性良好，灵敏度高，重现性好，可进一步用于阿仑膦酸钠药物代谢动力学研究。因此，该分析方法及结果可用于不同剂型,或改型后阿仑膦酸钠的药代动力学分析,并且可以联合质谱等建立更加灵敏﹑高效的分析方法。可见，反相高效液相色谱法应用的广泛。1.4超高液相色谱法超高液相色谱法（UltraPerformanceLiquidChromatography，UPLC）色谱理论认为提高色谱柱的效能（efficiency）就能增加仪器的解析度（resolution），而运用粒径低于2μm的小颗粒无疑是增加效能的好方法。但减小固定相的粒度以增加色谱柱效能一直是色谱仪器科学的瓶颈，因为小颗粒不仅要求系统能承受高于目前极限压力（比如6000psi/400bar），需要更小的系统体积（死体积），并且需要能适应可能只有几秒峰宽的高速检测器。与传统的高效液相（HPLC）相比，UPLC具有高分离度、高速度、高灵敏度的优点。朱凌【10】等就介绍了超高液相色谱的发展、理论基础、在药物代谢动力学中的应用及展望了它的应用前景。总结了UPLC具有能缩短分析时间和减少溶剂消耗等诸多优势，UPLC是一种柱效高，发展前景好的液相色谱技术。2质谱分析法质谱分析法(MassSpectrometry,MS)，即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出了离子的准确质量，就可以确定离子的化合物组成。质谱分析法分电子轰击质谱EI-MS，场解吸附质谱FD-MS，快原子轰击质谱FAB-MS，基质辅助激光解吸附飞行时间质MALDI-TOFMS，电子喷雾质谱ESI-MS等等，不过能测大分子量的是基质辅助激光解吸附飞行时间质谱MALDI-TOFMS和电子喷雾质谱ESIMS，其中基质辅助激光解吸附飞行时间质谱MALDI-TOFMS可以测量分子量100000。在新药开发过程中,为了预防潜在的毒性、测定是否有代谢物和已知药物相关,是否和原药具有相同的治疗作用或对其他治疗有内在的活性，有必要对代谢物进行结构鉴定。同时，这也能加速潜在候选化合物的开发【11】。张春花【12】介绍了质谱分析技术在儿童代谢性肝病诊断方面的应用。质谱分析技术已被公认为代谢性疾病化学诊断的有用手段，气相色谱质谱连用法可以对130余种代谢疾病进行筛选和化学诊断，串联质谱法可对30余种脂肪酸代谢异常疾患和部分氨基酸代谢异常同时筛查，作为先天性代谢疾病的新生儿筛查手段被广泛的应用在世界各国。代谢性肝病涉及不同的代谢途径的紊乱，多种儿童代谢性肝病都有疾病的特征性代谢谱存在，因此通过质谱分析的代谢组学研究将会对这类疾病的临床诊断非常有用。3光谱分析法在仪器分析中紫外—可见分光光度法是历史悠久、应用最为广泛的一种光学分析方法。它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析，所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外—可见分光光度法。朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度液层厚度乘积成正比，即A=κcl陈文华【13】等就利用了紫外分光光度法测定了血中利福平。取血清1ml，加2ml三氯乙酸，搅匀，静置5min，离心5min，弃去上清液，加10mol/LNaOH溶液0.5ml，复溶沉淀中利福平，搅拌，加5ml乙酸乙酯，静置5min，离心，取上清液，根据利福平具有紫外和可见光吸收特征，取利福平标准溶液，样品提取液，空白溶液，测定吸收曲线。结果利福平标准溶液,样品提取液在254nm处有一吸收峰,空白溶液无吸收峰。通过绘制工作曲线，得到了利福平的血中代谢含量。该方法简便,灵敏度适中,是检验血中利福平含量比较理想的方法。4联用分析方法随着分析仪器的不断改良，分析方法已经不限于仅仅使用一种了，由于联用技术可以克服其他单一分析方法的不足，越来越多的人选择了联用分析方法。包括气质联用法、液质联用法等。药物代谢动力学借助联用分析方法，更准确的对药物进行了一些测定。气质联用技术在石油化工、医药、食品、生化、农药、环境等方面的应用日渐重要，关翠林【14】等综述介绍了其在各领域的应用。陈楚雄【15】等利用液质联用法快速测定了人血浆中的洛西汀的浓度。得出了洛西汀在人体中血药浓度较低,仪器条件要求高,本实验采用LC-ESI-MS/MS方法检测,检测限低,最低检测限低于文献报道,但本法检测一个标本的时间远低于文献报道，将该法应用于临床血药浓度的测定,能够满足实验条件,可应用于临床血药浓度监测和药动学研究。杨梅【16】等也利用液质联用法测定人全血中替西罗莫司的药物浓度。此外，冯桂梅【17】等利用HPLC-MS测定了血浆中雷米普利和雷米普利拉浓度，并做了生物等效性研究。可见，液质联用法对于药物代谢动力学来说是一个不错的分析方法。此外，林慧【18】等利用全自动固相萃取与液质联用方法测定人体血浆中坦索罗辛血药浓度。陈建虎【19】利用固相萃取/离子阱气相色谱质谱联用对血液中多种安眠药物同时进行测定。药代动力学研究成果对阐明药物作用机理、指导新药的设计、优化给药方案、改进药物剂型等方面发挥着巨大的作用,然而药代动力学研究获得的资料最终能否用于临床实践或药物研究结果的解释和说明,取决于研究方案和生物样品分析方法的设计和实施【20】。我们应该利用现代的先进技术，改良分析方法，使分析方法更好的为药物代谢动力学研究服务。参考文献[1]胡灵,陈汇.药物代谢动力学在药物研究中的应用与进展[J].中国药师，2007,10（7）：651-653.[2]李敬来，崔孟珣，张振清，阮金秀.药物代谢动力学在药物研发中的意义和作用[J].解放军药学学报，2010,26（3）：258-261.[3]唐峰，杨焕民，等.体内药物分析方法的研究进展[J].食品与药品，2006,8（09A）：27-30.[4]邹黎.顶空气相色谱内标法测定血液中乙醇含量[J].临床医学与临床，2011，8（22）：2761-2762.[5]朱军，魏开芳，等.HPLC法测定防水中伊曲康唑的含量[J].济宁医学院学报，2006,29（2）