菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程

1菌种管理制度1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。3、定义标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。4、职责4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。5、规程5.1菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。5.2菌种的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。5.3菌种的保存5.3.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而2不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6个月转种一次；丝状真菌每年转种一次。5.3.2传代用菌种的保存采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。5.3.2.1甘油冷冻管保存法用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度20%），即为10%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，在-30℃冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第2代（G2）。可以每隔2年转种一代。使用时，取出一支放至室温，转种增菌培养或接种至琼脂斜面复苏，挑取纯菌落传代或工作用。此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏（如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌）。5.3.2.2液体石蜡保存法5.3.2.2.1无菌液体石蜡的制备：选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，在121℃灭菌30分钟,置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。5.3.2.2.2液体石蜡管的制备：将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适宜条件下培养结束后，在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于-20℃冷冻或2～8℃冰箱中保存。此法主要适用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽孢杆菌的保存（如枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。5.3.3各菌种的保存方法、条件及期限，见下表1表1传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限菌种名称保存方法保存温度保存期限大肠埃希菌〔CMCC(B)44102〕甘油冷冻管-30℃2年金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕铜绿假单胞菌（CMCC（B）10104）枯草芽孢杆菌〔CMCC(B)63501〕乙型副伤寒沙门菌〔CMCC(B)50094〕白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕液体石蜡管2-8℃1年黑曲霉菌〔CMCC(F)980035.4菌种的处理和保藏5.4.1标准菌株的复苏、确认、传代5.4.1.1标准菌株的复苏35.4.1.1.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球。5.4.1.1.2培养基改良马丁琼脂培养基：用于黑曲霉复苏、复壮；液体硫乙醇酸盐培养基：用于生孢梭菌复苏、复壮；营养肉汤培养基：用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮；改良马丁培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮5.4.1.1.3标准菌株的复苏操作步骤：以下操作均在生物安全柜内进行。a)在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。b)用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。c)以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8ml到安瓿中。d)轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。e)用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。f)根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。g)若黑曲霉为菌悬液，则先放置室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。h)取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按f）项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1~2ml/管，分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认，其余作为储备管在-30℃冷冻条件下保存。黑曲霉按g）项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种菌悬液中1~2ml/管加石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，封存于冻存管，置于-20℃冷冻或2～8℃冰箱中保存。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。i)储备菌种管制备成功，储存于－30℃，有效期为两年。5.4.1.2标准菌株的确认a)用无菌接种环取上述培养物接种到胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基（细菌）或沙氏葡萄4糖琼脂培养基（真菌和酵母菌）平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上。b)然后在30～35℃下培养3天（细菌）；20～25℃下培养5天（真菌和酵母菌）。c)培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划4个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和鉴定。d)鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种。e)若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻找原因。应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。f)菌种的确认结果，记录在《菌种鉴定记录》上。g)各菌种的复活、划线用培养基、培养条件，见《菌种复活、划线用培养基、培养条件》（附件2）。5.4.1.3菌种的传代5.4.1.3.1标准菌株的传代a)按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适宜的增菌培养基内，称第1代（G1），复壮后转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单个纯种菌落，此为第2代（G2）。b)菌种确认后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管或液体石蜡管，作为保存菌种（G2），也称传代用菌种，同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种，此为第3代（W3）。c)将第2代（G2）菌种管冷冻保存，将工作用菌（W3）于适当温度下培养适当时间后用于日常检验。d)取一支冷冻保存的第2代（G2）菌种转种于平板和斜面培养基上。平板上的菌种制成冷冻保存管第3代（G3）；斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后用作工作用菌种，此仍为第3代（W3）。e)将第3代菌种（G3）冷冻或低温保存，将生长、转种后的第2代（G2）菌种经高温灭活处理后丢弃。f)按上述规程操作，直至G4转为W5为止，需重新开启冷冻干燥菌种，重复上述规程操作，保存和使用菌种。g)当工作用菌种代数小于5时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。5.4.1.3.2传代用菌的传代将购回无异常的传代用菌种（一般为第3代），根据日常检验工作的需要量，挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种(为第4代)，同时，结合菌种的代数和最长保存期限，挑取纯菌落制成浓菌悬液按“5.3.2．”的方法制备甘油冷冻管或液体石蜡管数支，作为传代用菌种（仍为第3代）。55.4.1.3.2.1传代用菌的传代操作步骤从冰箱冷藏室（2~8℃）中取出菌种斜面后，应温室放置约30min。将装有新鲜配制的培养基和传代菌种一并移入生物安全柜内，打开紫外灯照射1小时。关闭紫外灯。酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种环，将接种环烧红约30s，5.4.1.3.2工作用菌种的传代当工作用菌种代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。取在冰箱4～8℃保存的工作用菌种用普通琼脂斜面传代，并将新传代的培养物替代原有的菌种，作为工作用菌种。也可取用“甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法”保存的菌种，进行复苏，直接作为工作用菌种。细菌每1个月传代一次；酵母菌每2个月传代一次；霉菌及芽胞每3个月传代一次。当超过5代，须用传代用菌种传代。5.4.4注意事项：传代时注意无菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丢失。同时实验人员也要采取有效的预防措施进行自我保护，如工作时必须穿工作服，佩带无菌手套，实验完成以后消毒实验进行的区域、实验仪器和器具。如发生意外，如菌种泄漏或人员受伤，微生物学检验人员应立即向部门主管报告以便及时进行处理。5.4.5传代后，按检定菌种的编号原则编号，并在每一支菌种管上贴上标签，标签内容包括：名称、编号、代数、传代日期、操作人、有效期。交部门主管统一保管。同时及时填写《菌种传代记录》（附表2）。5.5检定菌种的编号采用字母加数字表示：英文缩写字母—代次—传代日期—顺序号菌种的英文缩写字母：大肠埃希菌（E.c）、金黄色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢杆菌（B.s）、白色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副伤寒沙门菌（S.p）代数用一位带有下标数字的字母表示：传代用菌种用G表示；工作用菌种用W表示；如G3表示传代用菌种第3代；W3表示工作用菌种第3代。传代日期用6位数字表示：年份取最后两位数，月、日分别用两位数。如：2015年1月12日传代的第一支大肠埃希菌作为传代用菌种的编号为E.c-G3-120112-01。5.6检定菌种的保管5.6.1检定菌种设专人加双锁保管，并对所保存的菌种建立《检定菌种保存、领用登记台账》（附表3）。5.6.2检定菌种的定期检查与鉴定在菌种的保存期间，工作日应每天检查保存菌种冰箱的温度、必要时检查菌种管的塞子是否松动，是否染杂菌等，并及时填写《检定菌种观察记录》（附表4），如有异常应及时处理。菌种在保存期内均应根据菌种的特性（工作用菌种每转种两代一次、传代用菌种每6三个月一次）检查其菌落性状、革兰染色、显微镜下菌体形态，必要时检查生化特性等项目，若发现与原菌种变异较大，应重新分离、纯化、鉴定、再加以保存，并做好《检定菌种鉴定记录》（附表5）。5.6.3所保管的菌种，不能随意转让其他单位和个人，需要时应有单位证明和批准手续方可供应。5.7检定菌种的使用5.7.1微生