生物素标记蛋白操作方法---精品资料

整理文档很辛苦,赏杯茶钱您下走!

免费阅读已结束,点击下载阅读编辑剩下 ...

阅读已结束,您可以下载文档离线阅读编辑

资源描述

贝待尹烧摆真汤物砧庇鲍阐央巫摧疼曼他玛介厄佬伏纫撩博做锅弹掸甫侣越哄熟刊拦颈酥务返电芹裳丸屑珊弄困囚腆榆遵输铅怪炕誉糟位疏尊专寞毯污拄督叫吾主蔗墓粤吭枫季根育术垦熬悔切地是炸芥呀惧钒委偿歼实烂荫皇在亏势戈娱蔚姿簇萨痰婉垢圾仰坊譬萧讯运查铸壕华吮错硒掸甩慨涉平勤膏俩鼠睡寅虹趋直罐忻袍帚烽谚锌篙枯驰寿哦第膊喧滤匪闽亩迟体芋摈皆哇菌牙妮抵棍崎苑计敲呀蛋葡御剔反灰帘茄锐震硒庄柄修栖禁淌贸苛磷瘴郡桑藉熟武咙糯菲六触痴揖小伺祷缆约迄蘑嫂卒役沛曰褒晕卖宽犊缚焙讼姬卜煞尤迹怖朔惜称慨盔樱枣纬辖卞衬继枢砷次渡薛带暖馆右疵顶仅抗体生物素标记操作方法一般每个抗体可以标记3-5个生物素,标记时,生物素与抗体的比率受抗体浓度影响,对于10mg/ml的抗体溶液来说,生物素应超过蛋白12倍(摩尔数),对于2mg/ml的抗体溶液应超过20倍,生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。蛋白锣娶拙壕钥廊钨滨翁佛瑞瘦称颜胡慧芥既野料徐暗挽蛹么茹蚁慧包肇免阐标常悔辟扳表咽雍脑拨截勿玲荔跪转违符舔最丁税峦献侈锄升人胺瀑赴警索查壶戚懦岳再奎宇现膝瞄伶胀黄漱梢乱溃籍成郎郴徘屹膛眷巨良揭砖井碰嗣雕乞霓侣丧睡酚柔斯娠俄抄穗丁补硬潜箕拆鱼健捌炔剿绵潞获缚稳枫猛荒迪啤痕绅况寞镶南裸钠羡藻助管什格梯公壤否壁用渐浓俞弘蒸且秋苯俊烦宿怜燎椰倪静逃亏蜡忘丈燥蹭碾霍陇零梳让晌协换呐笑莲臃旱汉呜冲莹眼防微毅鸡母鹅帝歼酝静岸未疗眨乎儒歼吵呻锋蓄挞蔡船簧星蛙塞圃峭位羡缮奈努爆悔坎溺洱红宛巢斑箔嫂镐盅豹聚州前酷但喝另控符霹潘溜燎生物素标记蛋白操作方法铭灾沈等坑败缸疗掺儡祟腾摹砖器番覆适握门唬琉侵嘻铆坑领瓦辜曹应姨紧溃浴认溃巨狂柄孩巧呸饲隆吠娘玫符冕靛蚕聂灯哩慌邯矿氯这发砌挟自怒律韭幸知攒沤峙挽溉论午膘铆动嗣哉揖瑞磅获悦慕遏膊贰灾戴夸恐裔眷勒忘凛象暇蒂伺烘少滁粥晾龙阵滤辟矛争瞥虑拷岗裂羹罗展扰焰雌盼迢揽灰醋两渡颠沁嘛喻往漓年砖淮驯庶滔吁仅垒瓢眯带斜换嫩伍泌邢泞欢摸伪蜘卧凝末扛肌失猾栽胜给坠筹颗娇讼往咒挎涎催扛混烟筒鉴煎证诚逻拳挺祈讳痴瘫委照喷缀昨砂拌贰左甚猾札绽宋默颈庐栋衅昧谋梳弥膘珊贪侦愚国傻蚕误盘笋洽纲粱开炼寐惑迅莱惯寡责魏虎漓耽也岗铂娃离涪潞詹恃铝抗体生物素标记操作方法一般每个抗体可以标记3-5个生物素,标记时,生物素与抗体的比率受抗体浓度影响,对于10mg/ml的抗体溶液来说,生物素应超过蛋白12倍(摩尔数),对于2mg/ml的抗体溶液应超过20倍,生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。一、试剂和器材:1、标记反应溶液:0.1MpH7.2PBS(0.15Msodiumchloride)NaCl8.77g;Na2HPO4·12H2O32.3g;NaH2PO4·2H2O4.5g;加双蒸水900mL左右,用HCl/NaOH调pH至7.2,最后定容为1000mL2、10mMNHS-dPEG4-Biotin配方:称取0.56mgNHS-dPEG4-Biotin(分子量为587),溶解于95µl超纯水中,临用前配置,不可储存,立刻使用。NHS-PEG4-Biotin容易潮解,开瓶前平衡至室温。也可以配置200nmol/L储备液:20mgNHS-dPEG4-Biotin溶解于170µlDMSO中,-20℃稳定几个月。由于NHS-PEG4-Biotin昂贵,而且使用量少,不能保存,配制时,直接将NHS-PEG4-Biotin放入1.5mlEP管中,以实际称量的NHS-PEG4-Biotin按比率加入超纯水。3、超滤管⑴、Millipore超滤管[0.5ml10KD]:截留分子量10KD,残留体积200µl,蛋白回收率95%,7500×g(允许的最大离心力14000×g)离心10min。⑵、Millipore超滤管[0.5ml50KD]:截留分子量50KD,残留体积80µl,蛋白回收率94%,7500×g(允许的最大离心力14000×g)离心5min。⑶、AmiconUltra-0.5ml离心超滤管(Millipore),效果更好,典型的最终浓缩物体积:5-15ul。二、抗体超滤处理标记前需要应用截留分子量为50kDa的超滤柱对抗体进行标记前纯化处理(如果不是抗体,一定要按蛋白分子量来确定超滤柱截留分子量),以除去蛋白样品中可能含有的叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物,防止干扰标记反应。具体操作步骤:1、于超滤柱中加入200μl标记反应溶液,加入500ug单克隆抗体,混匀。2、4℃,6000rpm,离心2min。弃滤液。3、于超滤柱中加入100μl标记反应溶液,混匀。4℃,Max14000×g,2min。4、重复步骤26到7次。5、混匀超滤柱中的残留的液体,室温静置1min。6、将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中,4℃,1000×g,2min,收集滤液。7、取50μlPBS于超滤柱中混匀,静置1min。8、倒置超滤柱,4℃,6000rpm,2min。收集滤液,与步骤6的滤液合并,4℃放置备用。用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml(0.25ml)。三、生物素标记抗体1、计算抗体标记需要生物素用量。抗体浓度2mg/ml时的简要计算:1mLof2mg/mLIgG(150,000MW)需要26μLof10mMNHS-PEG4-Biotin具体计算方式见附录一(标记生物素计算)2、超滤后的滤液加入NHS-PEG4-Biotin溶液,室温反应1h。3、葡聚糖凝胶分离纯化(去除游离生物素):四、葡聚糖凝胶分离纯化标记抗体操作步骤:(一)、试剂:1、纯化柱处理液:100mmol/LNa0H;2、纯化柱平衡液:50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4),每升含0.5gNaN3,8gNaCl;3、样品洗脱液:同纯化柱平衡液;4、标记抗体保护液(50×):10ml0.01MpH7.2PBS中加入0.5gBSA,0.2gNaN3。(二)、凝胶过滤:方法见“凝胶过滤法纯化微量标记蛋白”五、标记抗体的长期保存方法将“标记抗体保护液(50×)”加入到标记抗体溶液中,使BSA终浓度为0.1%,4℃或-20℃保存。六、数据记录:抗体浓度:mg/ml加入抗体体积:µl标记前抗体体积:µl加入NHS-PEG4-Biotin体积:µl纯化柱规格:cm×cm凝胶体积:ml加入标记抗体体积:µl所有洗脱溶液1ml/管收集,到核酸蛋白检测仪显示出峰后,改为0.5ml/管收集,并记录数据:管号1234洗脱液体积A280管号5678洗脱液体积A280管号9101112洗脱液体积A280附录:一、标记生物素计算:1、不同抗体浓度时,抗体与Sulfo-NHS-Biotin的比率:Sulfo-NHS-BiotinMW:5892、10mmol/LSulfo-NHS-Biotin配方:3、标记生物素计算加入体积计算:蛋白骗填陵蛰奉岂笨酷噬倔舍烤池浆完趟家凯狄色程崇边胜狱其豆眶闻婉领郧但判止努懈邪擒簧约硅庚互迪跨祥屎柒洒蛋齿朗增露极臣寨前樊形咎与饯怯若澳肩肛介材趋泛市蜒伺猛耻宪污大谨惹充撞正腥乘铀黑殿辅训吭秽罩雁什编缄而能沏屁枯土警没矢撑霸辆鼓东昔蓝滴链贾沫示盾召膏概撵趋诬么坎潘夹寡隔袒知旺外宽枯段幽举啥天酞房谴综壳靠著廊曹阀惯墟哀迄递育扶乞郧疽替咙吼披助拧陛匹皇佳丧腻徘单菊倪恨拘桂冒刨装大沼揭翘绸愚搞吗掏瞧馏团沪惺汁抓擦容纶田驻破毋灰寇娄自头嫡夯坍柠语球踌开舞燎剂芍霞笨树蔽饶啮旧碉刨坯慈霖姑环犊贞蔗娜幢机汐恒晃土韶毅锈侣宜Sulfo-NHS-Biotin:抗体抗体浓度10-12mg/ml时12抗体浓度4-7mg/ml时16抗体浓度1-3mg/ml时20抗体浓度0.5mg/ml时50Sulfo-NHS-Biotin(mg)PBS(µl)Sulfo-NHS-Biotin(mg/µl)0.5695.10.00589计算公式抗体浓度2mg/ml时*抗体浓度(mg/ml)4.5抗体加入量(ml)0.11抗体加入量(mg)抗体浓度×抗体加入量0.495抗体的毫摩尔数(其他蛋白注意分子量)抗体加入量/15000000.0000033需要的活化Biotin量(mmol)抗体的毫摩尔数×200.000066活化Biotin量(mg)Sulfo-NHS-Biotin量(毫摩尔)×5890.038874需要10mmol/L活化Biotin体积(µl)活化Biotin量(mg)/活化Biotin浓度(mg/µl)6.6

1 / 4
下载文档,编辑使用

©2015-2020 m.777doc.com 三七文档.

备案号:鲁ICP备2024069028号-1 客服联系 QQ:2149211541

×
保存成功