淀粉酶活力的测定

淀粉酶活力测定一、实验目的以所筛选出的芽孢杆菌为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。通过本实验要掌握测定酶活的方法。二、实验原理淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖与DNS试剂共热呈阳性反应，产生红棕色；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。酶活力也称酶活性，是以酶在最适温度、最适pH等条件下，催化一定的化学反应的初速度来表示。本实验是以一定量的淀粉酶液，于37°C、pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间里将淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色测定，求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力。这里规定，一个淀粉酶活力单位定义为在37°C、pH6.8的条件下，每分钟水解淀粉生成1mg还原糖所需的酶量。三、实验材料及设备1、筛选出来的产淀粉酶芽孢杆菌。2、菌种：从商丘师院土壤中分离出的产淀粉酶的芽孢杆菌3、种子培养基：蛋白胨1%,酵母浸出物0.5%,氯化钠1%,pH自然4、发酵培养基：按正交试验所选的最佳方案来配置5、仪器：控温摇床、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、分光光度计、烧杯、玻璃棒、锥形瓶、离心机、刻度试管：25mL×4、容量瓶：100mL×1、烧杯：250mL×1、滴管2支、洗耳球2支、洗瓶、试管架、移液管架、移液管、玻棒：各1支四、试剂的配制1、培养基的配制按上述配方称量、溶解、灭菌2、淀粉溶液（0.5%）称取5g可溶性淀粉，溶于1000mL热水中。（临用前配制）蔗糖溶液（1%）3、3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）将5.0g3,5-二硝基水杨酸溶于200mL2NNaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000mL。暗处保存备用。4、磷酸缓冲液（0.2mol/L，pH6.8）5、NaOH溶液（6mol/L）6、NaCl溶液（0.3%）五、操作步骤1、淀粉酶的制备(1)菌的培养菌种活化：将保存的菌种转接到斜面培养基,37℃培养24h,备用。种子液的制备：取一环活化的菌种,接入装量为50mL种子培养基的250mL三角瓶中,37℃,180r/min培养18h。摇瓶培养：分别取1mL种子液,接入盛有50mL发酵培养基的200mL三角瓶中(接种量为2%,V/V)。置摇床中,30℃振荡培养24h,转速为160r/min（2）酶的提取：液体培养基在3000r/min的离心机中离心10min，取上清；2、淀粉酶活力的测定取25mL刻度试管4支，按下表编号并操作，记录实验结果。管号试剂（ml）1234pH6.8缓冲液1212蔗糖溶液11淀粉溶液11淀粉酶液11酶促反应摇匀，37℃水浴5minDNS试剂2显色反应沸水浴5min光密度（D540）六、结果处理根据上表的实验结果，以蔗糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制出标准曲线。α-淀粉酶活性由下式求得：A=（500×f/m）×〔100/（100-h）〕×（lgD1-lgD2）/（t1-t2）=500×f·b/m）×〔100/（100-h）〕式中：A──α-淀粉酶活性；m──100mL氯化钙提取的试样质量，g；h──试样中水分含量，％；f──酶提取液的稀释倍数；t1、t2──不同的反应时间，min；D1、D2──时间t1、t2时的吸光度；b──lgD对t的曲线的斜率的绝对值；500──系数。