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课程目标1、理解工业发酵常用灭菌方法的基本原理和适用范围2、掌握工业发酵培养基和发酵罐设备的灭菌工艺的选择3、掌握无菌空气制备的基本知识和典型工艺流程概述1、发酵工业大都是纯种培养，生产过程只能有生产菌，不允许有其他菌（危害）2、保证纯种发酵，在生产菌种接种之前要对培养基、空气系统、流加料、发酵罐及管道系统等灭菌，对环境要消毒.几个概念：消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、环境中的一切病原微生物（表面）一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。灭菌：用物理或化学方法杀死或除去所有微生物除菌：采用过滤方法除去空气或液体中的微生物或孢子。第一节灭菌方法一、灭菌方法1热灭菌法2辐射灭菌法3化学灭菌法4过滤除菌法1、热灭菌法：原理：加热使微生物蛋白质变性包括：干热灭菌法、湿热灭菌法（1）干热灭菌法火焰灭菌：采用火焰直接杀死微生物。如接种针、接种环等的灭菌。该方法应用范围有限。干热灭菌：概念：在红外线或电热作用下，在设备内加热，主要用于保持干燥的物料、器具等灭菌。方法：常用在烘箱内，烘箱内的温度160~170度，维持1~2小时注意：不能超过180度、灭菌物体不能放得太紧、降温时缓缓进行、温度降到80度以下时才能开烘箱门。原理：氧化作用缺点：干热的穿透力弱，微生物对干热的耐受力比湿热强很多，需要的灭菌温度相比较要高，时间要长。（2）湿热灭菌原理：借助蒸汽释放的热，使微生物细胞中的蛋白质、核酸、酶分子内的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。热阻：微生物在某一种条件下的致死时间。适用范围；广泛用于生产设备、培养基的灭菌。同温下相对于干热灭菌，杀菌效力更强。原因：（1）湿热条件下，菌体吸收水分，蛋白质更易凝固。原因：含水量加大，所需凝固温度降低。（2）湿热蒸汽的穿透力大（3）湿热的蒸汽有潜热存在湿热灭菌方法分为：煮沸灭菌法、巴氏消毒法、间歇式、高压蒸汽灭菌法煮沸法：将要消毒的物品放入水中煮沸（100度）。煮沸时间：15—20分，杀死微生物营养细胞1—2h，杀死芽孢。加碳酸钠或石炭酸(0.5%)对象：适用食品或器材的消毒巴氏消毒法：待消毒的物体在60～62℃加热30min或在70℃加热15min，杀死病原菌和一部分微生物。对象：牛奶、啤酒、黄酒、酱油等食品特点：不损害某些食品的营养价值和色香味举例：啤酒的灭菌间歇灭菌法：采用反复几次常压蒸汽灭菌法。杀死微生物营养体和芽孢。具体方法：待灭菌物品，放入灭菌器中加热到100℃，维持30～60min，取出，冷却，37℃恒温箱中培养1小时，次日同法处理。共三次对象：不宜高压灭菌的物质。如糖类明胶牛奶培养基等高压蒸汽灭菌：主要使用密闭的高压蒸汽灭菌锅。使用广泛。方法：压力0.1MPa，温度121度，维持15—30min.注意事项：灭菌完毕，缓缓减压总结优缺点：湿热灭菌优点：蒸汽来源容易、蒸汽穿透力强，灭菌彻底、蒸汽有很大潜热、可调节压强湿热灭菌的缺点：设备费用高，不能用于怕受潮的物料的灭菌。2辐射灭菌辐射灭菌：利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物。紫外线最为常用。适用范围：接种室，超净工作台、无菌培养室及物质表面。注意事项：紫外线穿透率力底，只能用于表面灭菌。30W紫外线灯照射30min，可取到杀菌效果。一般和化学试剂合用紫外线灭菌机理：使微生物的DNA链断裂，破坏核糖和磷酸的连接引起DNA分子内或分子间氢键断裂，使微生物死亡化学灭菌法化学灭菌法：化学药品直接作用于微生物将其杀死的方法。适用范围：生产车间、无菌室、实验室、接种前的小型器具及手的消毒。使用方法：浸泡、添加、擦拭、喷洒等化学灭菌机理化学物质容易与微生物细胞中的某种成分产生化学反应。如蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性，杀灭微生物。注：不适合培养基的灭菌，适用于局部空间或器械的灭菌。例：P46常用化学灭菌剂，共7种第二节培养基和发酵设备的灭菌一、培养基灭菌条件的选择条件选择原则：能达到灭菌、营养基成分破坏最少。1、灭菌温度和时间选择：（对数残留定律）营养成分破坏分解反应：dc/dt=-kc(k为速率常数）阿累尼乌斯方程：K’=A’e-E’/RT(1)菌体死亡也属一级动力学：K=Ae-E/RT(2)由（1）和（2），得到结论：随着温度的升高，灭菌反应速度常数的增加倍数大于营养成分破坏反应速度常数增加的倍数。用Q10表示。灭菌方法：采取高温快速灭菌2、影响培养基灭菌效果的因素（1）培养基的成分油脂、糖类、蛋白质、低质量分数（1%--2%）NaCl溶液（2）pH值：pH为6—8，微生物最耐热，pH小于6，氢离子易渗入微生物细胞内，改变细胞生理反应促使其死亡。pH愈低，灭菌所需时间愈短。（3）培养基中的颗粒。颗粒大，灭菌易；颗粒小，灭菌难（4）泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，传热困难。难以杀死微生物。二、培养基的灭菌方法（一）分批灭菌是在每批培养基全部流入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽，加热至灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到接种温度。实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌。特点：不需要其他附属设备，操作简单，为常用的灭菌方法缺点：加热和冷却时间长，营养随时间增长而降低，发酵罐利用率低，不能采用高温快速灭菌工艺。罐体容积越大，，加热和冷却时间越长。分批灭菌时间：T总=t1+t2+t3。其中t1、t2、t3分别为加热、维持、冷却时间注意事项：预热时间、操作、管道的衔接处等的灭菌问题（二）、连续灭菌（连消）指培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌冷却后送入已灭菌的发酵罐的灭菌工艺过程。温度：126—132度，总蒸汽压力：0.044—0.049MPa以上。优点：营养成分破坏少，发酵罐非生产占用时间短，容积利用率高，蒸汽负荷均匀，锅炉利用率高，适用于工业化生产。缺点：不能用于黏度大、固形物含量高的培养基；增加了连续灭菌设备、增加了染菌概率。分类：按设备和工艺来分：（1）蒸汽直接加热连续灭菌（2）蒸汽间接加热连续灭菌1、蒸汽直接加热连续灭菌系统定义：蒸汽直接加入到培养基中，快速加热到杀菌温度，维持一段时间，冷却到发酵温度的过程。分两种形式：（1）连消塔、维持罐和冷却器组成连续灭菌系统配料罐将培养基预热到60—70度，防止培养基在杀菌时料液与蒸汽温度相差过大，而产生水汽撞击声（危害）连消塔使培养基迅速升温（20s)（126—132度）维持塔：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间（5—7min)冷却塔：将培养基迅速冷却到40—50度，输送到灭菌后的发酵罐内。（2）喷射加热、维持管和真空冷却器组成的连消系统蒸汽直接喷入培养基中，培养液急速升温到预定灭菌温度，培养基在此温度下，维持一定时间后，通过一膨胀阀进入真空冷却器而迅速冷却。保证培养基先进先出，避免过热或灭菌不彻底。优点：升温快、营养成分损失少、缺点：培养基随蒸汽冷凝而稀释。2、蒸汽间接加热连续灭菌系统蒸汽不直接与培养基接触，通过热交换器对培养基加热热交换器有：板式和螺旋板式两种螺旋板式特点：适用于含固行悬浮物的培养基灭菌。流道宽，流速快，减少热交换器表面的结垢。灭菌过程：新鲜培养基→残热回收器→加热到90~120℃→第二个热交换器→140℃→维持30~120S→第三个热交换器（冷却）→到符合要求温度的培养基（20~30S）注意：含淀粉的培养基，要水或酶解含颗粒的培养基，增加灭菌时间三、发酵设备灭菌1、实罐灭菌：培养基同发酵罐一起灭菌2、培养基连续灭菌：空罐先灭菌。方法：蒸汽，压力为0.147~0.180Mpa,45~60min.空消之后不能立即冷却，用无菌空气保压，灭菌后的培养基或相关物料输入后，冷却。发酵用。附属设备灭菌：（1）分空气过滤器。发酵罐前灭菌（2）补料罐：灭菌温度确定要视物料情况（3）补料管路、消泡剂管路与补料罐、油管等同时灭菌第三节空气除菌概述1、需氧发酵需要氧气，特别是深层发酵要不断将空气通入发酵罐。2、空气中有微生物和灰尘等，在通入发酵罐前要严格处理3、发酵类型不同，对于空气的无菌程度要求不同。4、发酵工业无菌空气的制备方法：介质过滤除菌法一、空气中的微生物分布特点附着在尘埃和雾沫上、数量和分布随地区、高低、季节、空气中尘埃多少不同而不同。二、空气除菌方法加热灭菌法、静电除菌法、介质过滤除菌法。（一）加热灭菌法：将空气加热到一定温度，维持一段时间，杀灭空气中微生物的方法。工业化采用空气空气压缩过程产生的热量灭菌。（对于无菌程度要求不高的发酵过程可采用）（二）静电除菌。灰尘和细菌的空气，产生电离，产生的离子使灰尘和微生物成为载电体，捕集在电极上。（三）介质过滤除菌：空气通过经高温灭菌过的介质过滤层，微生物等颗粒阻截在介质层。工业上大多数采用。三、介质过滤除菌按机制分：绝对介质过滤除菌、深层介质过滤除菌（一）绝对介质过滤除菌过滤介质之间的空隙小于被滤除微生物。过滤介质是各种微孔滤膜。由超细纤维制成，孔径小于0.45um.工业化：折叠膜滤芯的过滤器。（二）深层介质过滤除菌过滤介质空隙和过滤介质纤维的直径大于被除去微生物。除菌机制：网格阻碍气流直线前进，气流改变方向和速度，引起微粒与滤层纤维产生碰撞、阻截、静电吸附和扩散等。被截流在介质中。（1）、惯性碰撞作用：微粒惯性较大，不能及时改变方向，冲到县委表面，摩擦黏附。作用大小取决于颗粒的动能、纤维阻力、气流速度。其与气流速度成正比。（2）、阻截作用气流速度降到临界速度以下时，纤维对微粒的捕集效率增加。（3）、扩散作用布朗运动。在很慢的气流和较小的纤维间隙中，扩散作用大大增加（4）、重力沉降作用与阻截作用相配合，增强了阻截捕集作用（5）、静电吸附（三）介质除菌效率概念：指被介质层捕集的尘埃颗粒数与空气中原有的颗粒数的比。实质：空气中的微生物大大延长了在空气中的停留时间，在发酵周期内，保证不让空气中的杂菌漏进发酵罐内。公式：P=N2/N1P为透过率，N1为过滤前的微粒数，N2为过滤后的微粒数除菌效率:η=（N1－N2）/N1=1－P注意：在实际生产中，N2取0.001.含义是1000次发酵中有一次因空气带菌而染菌。