PCR引物设计的黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。3.引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃。GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(meltingtemperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。4.引物3′端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。5.引物3′端不能选择A,最好选择T。引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,G、C错配的引发效率介于A、T之间,所以3′端最好选择T。6.碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(Falsepriming)。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer与Crossdimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其△G值不要过高(应小于4.5kcal/mol)。否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8.引物5′端和中间△G值应该相对较高,而3′端△G值较低。△G值是指DNA双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,△G值越大,则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高,而3′端△G值较低(绝对值不超过9)的引物。引物3′端的△G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。(不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析)9.引物的5′端可以修饰,而3′端不可修饰。引物的5′端决定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。10.扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件(比如RNAstructure)可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。11.引物应具有特异性。引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了。POSTbyBingsenXu前言:我是刚刚注册到丁香园,在PCR技术讨论版看见置顶贴,“请求助引物设计的战友先进来这里!”稍微浏览了一下,发现很多朋友对PCR引物设计还不是很熟悉,我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享,希望不会做引物设计的朋友看完之后,可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。开始之前:其实非常简单,不需要你下载任何软件,但是你得有一台电脑能上网。当然,最重要的是,你要很清楚用于做引物的模板序列,至于怎么找模板序列,不再本贴的讨论范围。另外,要先对PCR目的序列的长度有个大致估计,好了,马上开始吧:第一步:找到Primer3的站点。你不用记住这个站点,但是要记住“Primer3”这个词,然后打开GOOGLE首页,输入Primer3,跳出来的第一个项目就是了“Primer3Input0.4.0(primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是。第二步:贴上模板序列。进入Primer3站点,可以看到一个引物设计的界面。(附件Word文档里有图)在“Pastesourcesequencebelow(5'-3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'-3'方向的,数字或者空格都没关系,软件会自动过滤的。第三步:重要参数设定。首先是“ProductSizeRanges”,如果你不希望软件给你随便做的话,首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000,这个你得自己改,如果你希望产物的大小符合你的预期,尽可能把范围改小,比如480-500,具体看情况调整。第二个参数是“PrimerSize”,默认值一般可以用,但是,当你用熟了这个软件,你自己就知道该怎么改了。第三个参数是”PrimerTm”这个和PrimerSize差不多。第四步:Pickprimers:点一下这个按钮,符合你大小预期的primer就出来了,看看Primer3Output的界面,多么漂亮!你要的primer出来了,而且有primer在序列上的位置比对图,还有primer本身的信息,包括位置,长度,Tm,GC含量,任何位置互补碱基数,3'端互补碱基数,以及引物序列,(注意,下游引物是5'-3'),还有产物大小,两引物间任意互补碱基数,两引物间3'端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内,但还不是最佳,将会给出警告。比如(随便举例,本人在做一个超长引物):WARNING:Leftprimerisunacceptable:High3'stabilityOLIGOstartlentmgc%any3'seqLEFTPRIMER13369.0245.456.001.00TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCRIGHTPRIMER13883467.8629.416.002.00AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCESIZE:1388INCLUDEDREGIONSIZE:1388PRODUCTSIZE:1388,PAIRANYCOMPL:5.00,PAIR3'COMPL:3.00第五步:引物设计检验:可以仅仅设计一向引物,只要在Pickleftprimer或者Pickrightprimer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物,放在Primer框里,(注意,下游引物的书写反向仍然是5'-3')如果符合设定的条件,软件将对给出引物评分,同时给出警告信息,根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可,警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物,最好都要检查一下,这样就可以避免被别人有意无意误导。至于RT-PCR所用的引物,最好是使得产物跨过内含子,这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。实际做引物的时候,要把内含子都去掉,仅仅把外显子序列放入源序列框中,并且通过自定义引物设计的方法,使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR,我将抽空另做说明。至于设计出来的引物的实际效果,根据我的经验,一般情况下都能做到PCR一次成功,也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果,但是不管怎么说,软件做引物可以让自己心中有数。最后,GOODLUCKTOEVERYONE.手把手教你在线做PCR引物设计POSTbyBingsenXu前言:我是刚刚注册到丁香园,在PCR技术讨论版看见置顶贴,“请求助引物设计的战友先进来这里!”稍微浏览了一下,发现很多朋友对PCR引物设计还不是很熟悉,我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享,希望不会做引物设计的朋友看完之后,可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。开始之前:其实非常简单,不需要你下载任何软件,但是你得有一台电脑能上网。当然,最重要的是,你要很清楚用于做引物的模板序列,至于怎么找模板序列,不再本贴的讨论范围。另外,要先对PCR目的序列的长度有个大致估计,好了,马上开始吧:第一步:找到Primer3的站点。你不用记住这个站点,但是要记住“Primer3”这个词,然后打开GOOGLE首页,输入Primer3,跳出来的第一个项目就是了“Primer3Input0.4.0(primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是。第二步:贴上模板序列。进入Primer3站点,可以看到一个引物设计的界面。(附件Word文档里有图)在“Pastesourcesequencebelow(5'-3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'-3'方向的,数字或者空格都没关系,软件会自动过滤的。第三步:重要参数设定。首先是“ProductSizeRanges”,如果你不希望软件给你随便做的话,首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000,这个你得自己改,如果你希望产物的大小符合你的预期,尽可能把范围改小,比如480-500,具体看情况调整。第二个参数是“PrimerSize”,默认值一般可以用,但是,当你用熟了这个软件,你自己就知道该怎么改了。第三个参数是”PrimerTm”这个和PrimerSize差不多。第四步:Pickprimers:点一下这个按钮,符合你大小预期的primer就出来了,看看Primer3Output的界面,多么漂亮!你要的primer出来了,而且有primer在序列上的位置比对图,还要primer本身的信息,包括位置,长度,Tm,GC含量,任何位置互补碱基数,3'端互补碱基数,以及引物序列,(注意,下游引物是5'-3'),还要产物大小,两引物间任意互补碱基数,两引物间3'端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内,但还不是最佳,将会给出警告。比如(随便举例,本人在做一个超长引物):WARNING:Leftprimerisunacceptable:High3'stabilityOLIGOstartlentmgc%any3'seqLEFTPRIMER13369.0245.456.001.00TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCRIGHTPRIMER13883467.8629.416.002.00AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCESIZE:1388INCLUDEDREGIONSIZE:1388PRODUCTSIZE:1388,PAIRANYCOMPL:5.00,PAIR3'COMPL:3.00第五步:引物设计检验:可以仅仅设计一向引物,只要在Pickleftprimer或者Pickrightprimer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物,放在Primer框里,(注意,下游引物的书写反向仍然是5'-3')如果符合设