基因克隆的技术

1基因克隆技术摘要：基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。关键词：目的基因；限制性内切酶；克隆；重组分子ABSTRACT：Genecloningtechnologyisthecoreofmolecularbiologytechnology,itspurposeisobtainageneorDNAfragmentsofthecopy,usedforin-depthanalysisthestructureandfunctionofgenes,andmayachievehumancellsandthetransformationofthespeciesgeneticspurpose.Thisthesismainlyfromthefollowingseveralaspectstointroducegenecloningtechnology:thepurposeofthegeneforthepurpose,genesandcarrier,restructuringofthemoleculesconnectedamplificationandidentification.Keywords：purposegene;restrictionendonuclease;clone;restructuringmolecules基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。1.目的基因的获得目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。所需目的基因的来源,不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选[1]1.1PCR方法21.1.1PCRPCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA[2]。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制[3]。PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40～60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍[4]。1.1.2RT-PCR反转录PCR（RT-PCR）又称为逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术[4]。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。31.1.3real—timePCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国appliedbiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规的PCR相比，它具有特异性更强，灵敏度高，重复性好，定量准，等优点，目前已得到广泛应用[5]。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术不仅广泛地应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于兽医临床。其应用涉及到的范围包括病原体的检测、基因表达的定量和等位基因的鉴定等多个领域[6]。实时定量PCR反应是在带透明盖的塑料小管中，激发光可以直接透过管盖，使其中的荧光探针被激发。荧光探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA结合后，才能够被激发发出荧光。随着新合成目的DNA片段的增加，结合到DNA上的荧光探针，即被激发产生的荧光相应增加[3]。Woo等[11]利用SYBRGreenI作为荧光染料建立了一种鉴定钩端螺旋体的方法，利用熔点曲线分析来区别特异产物、引物二聚体和非特异性产物，不需要电泳来鉴定，该方法快速而敏感，整个过程在20min内完成。Jamest51等应用TaqMan探针建立了从小牛腹泻粪便中定量检测水源性寄生虫小隐孢子虫的Cj基因和18SrRNA的方法。Frank等[12]建立了基于TaqMan探针的实时RT-PCR方法，从感染马传染性贫血病毒(EIAV)的马血浆中定量检测EIAV的荷裁量，比竞争性RT—PCR更省事，有更大的检测范围。1.2基因组文库或cDNA文库的构建和筛选将基因组DNA用限制性内切酶消化后插入到适当载体中，得到含有不同插入片段的克隆载体，这种克隆载体的混合物含有长短不同的基因组片段，这就是基因文库。若将细胞内所有mRNA均逆转录成cDNA，然后将所有cDNA片段克隆到适当的载体中，构建成含有不同cDNA片段的克隆载体混合物，这就是cDNA文库。cDNA的合成可用RT-PCR法，也称反转录PCR[9]。它是一种酶促合成法,即以mRNA为模板,在反转录酶的作用下,以4种脱氧核苷三磷酸为材料合成DNA(cDNA),再经复制后即成双链DNA。从真核生物中提取mRNA,由于mRNA后有100-200bp的Poly(A),用与Poly(A)互补的12-18个核苷酸的Oligo(dT)合成的一种组织中所有mRNA对应的cDNA第一链。然后使用末端转移酶在cDNA第一链末端加上多聚C,经变性和水解mRNA后,加入1个末端为多聚G的引物合成其互补链(第二条链),再经PCR进行大量扩增。因为真核生物的基因由编码4的外显子和大量不编码的内含子两种序列组成,用这种方法得到的基因没有内含子,不具有启动子和终止子,所以缺乏功能活性。如果外接一段调节序列,就能在受体细胞中表达,所以此法是克隆真核生物基因的有效方法[7]。自从1970年Temin等发现反转录酶以来,此法已广泛应用于人[8]、猪、田鼠、鸭子。当获得了基因组文库或cDNA文库，可以根据已知的信息合成特异性探针，采用核酸分子杂交的方法从文库中筛选感兴趣的基因片段，这仍是目前获得新基因的一种常用手段。1.3化学合成法制备基因片段采用DNA合成仪，对目的基因进行分段合成，然后进行连接，可以得到所需的目的基因。化学合成法可以改变原始的基因序列，甚至可以合成自然界不存在的序列。在合成过程中可以根据需要改变核苷酸的密码子，如将真核基因序列中不易在E.coli中利用的稀有密码子改成E.coli偏爱的密码子，有利于真核基因在E.coli中的表达。2.重组质粒的构建DNA体外重组是将目的基因在DNA连接酶作用下，连接到合适的载体DNA上，以便下一步转化之用。这种由两种不同DNA片段重新组合而成的DNA称重组DNA，简称重组体。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连[10]。很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正5确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12～16℃，连接12～16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。3.重组分子的扩增和鉴定3.1重组DNA分子导入受体细胞目的基因和载体在体外连接形成重组DNA分子后，需要被导入受体细胞中才能进行增殖和（或）表达。接受重组DNA分子的细胞称作受体细胞或宿主细胞。受体细胞分为原核细胞（如大肠杆菌）和真核细胞（如酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞）。原核细胞可作为基因复制扩增的场所，也可作为基因表达的场所；而真核细胞一般只用作基因表达系统。受体细胞是重组基因增殖的场所，所以对受体细胞也应具有几点要求：①容易接纳重组DNA分子；②对载体的复制扩增无严格限制；③不存在特异的能降解外源DNA的内切酶体；④不对外源DNA进行修饰。由于载体的不同，所具备的筛选标志不同，所用的受体细胞也不同，因此可根据所用的载体选择合适的受体细胞。一般将重组DNA分子导入原核细胞的过程称为转化，而导入真核细胞的过程称为转染。未经处理的大肠杆菌很难接受外源重组DNA分子，但经物理或化学方法处理后，细菌对摄取外来DNA分子变得敏感了，这种经处理而易接受外源DNA分子的细胞叫做感受态细胞。将重组DNA分子和感受态大肠杆菌细胞相混合，使重组DNA分子进入大肠杆菌中，就可以实现重组DNA分子的转化