抗真菌活性实验方案

十三种样品抗真菌活性测定1实验仪器及试剂仪器：ZHJH-C1112C型垂直流超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）、全自动不锈钢立式电热蒸汽压力消毒器（上海三申医疗器械有限公司）、LRH-250A-G型生化培养箱（广东省医疗器械厂）、FA1004型上皿电子天平（上海天平仪器厂）、96孔板、试管、移液枪（0-200μL）、接种针、酒精灯等。试剂：酮康唑（纯度为99.7％，Sigma公司）、甲醇（分析纯，天津科密欧化学试剂公司）、葡萄糖、琼脂、KH2PO4、MgSO4、柠檬酸、VB1。2实验材料供试菌种：小麦赤霉病菌（Gibberellezeae）、番茄灰霉疫病菌（Botrytiscinerea）、烟草疫霉菌（Phytophthoranicotianae）和白色念珠菌（Candidaalbicans），以上菌株均为本实验室保存菌种。供试化合物：…………………………………………改良CPDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，柠檬酸0.1g，VB110mg，蒸馏水1000mL，pH6.5（固体培养基加20g琼脂），121℃灭菌20min。3实验方法3.1菌种的活化配制CPDA培养基，分装于试管中，每管约5mL，121℃灭菌30min，取出倾斜放置，自然冷却凝固成斜面。然后，于无菌条件下用接种针于保藏菌种斜面挑取菌丝体用直线法将菌种接种于晾好的斜面上，于培养箱中28℃活化72h备用。3.2菌悬液的制备取活化好的供试菌，接于200mL液体培养基中，于28℃、150rpm摇床培养72h至菌液浓度均匀，再将浓度均匀的菌悬液与45℃固体培养基以1：50的体积比混合均匀，得到供试菌悬液。3.3对照药品溶液及样品溶液的制备（1）阳性对照药品为酮康唑，用甲醇将其溶解，配制成1mg/mL的储备液。采用2倍稀释法稀释样品，得到一系列浓度对照溶液（250μg/mL、125μg/mL、62.50μg/mL、31.25μg/mL、15.62μg/mL、7.81μg/mL、3.91μg/mL）。（2）将待测样品溶解于甲醇中，配制成1mg/mL的样品储备液。采用2倍稀释法稀释样品，得到一系列浓度样品溶液（500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL）。3.4MIC（Minimuminhibitoryconcentrations）的测定（1）将对照药品、待测样品溶液及96孔板置于超净工作台，紫外灯照射30min；（2）移取100μL菌悬液加到96孔板中；（3）分别移取20μL对照药品溶液及样品溶液加到96孔板中，每个浓度设两个平行（未加待测样品溶液只含菌悬液的为阴性对照，只含培养基的为空白对照）；（4）将96孔板置于28℃恒温培养箱中培养72h，肉眼观察没有真菌生长的最小的样品浓度即为MIC值。参考文献[1]LingLiu,ShuchunLiu,XulinChen,LiangdongGuo,YongshengChe.PestalofonesA–E,bioactivecyclohexanonederivativesfromtheplantendophyticfungusPestalotiopsisfici.[J].Bioorg.Med.Chem.2009,17:606–613.