pBM16A-TOPO快速克隆试剂盒说明书

pBM16A-TOPOCloneSmartkit保存条件：-20℃保存，有效期一年。试剂组成：产品介绍：pBM16A-TOPO快速克隆试剂盒利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(TopoisomeraseI)的切割再连接的特点将片段克隆到载体中。不仅适用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物，也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶扩增的带A尾的PCR产物。试剂盒中的pBM16A-TOPO载体为线性化的质粒。可以用引物对M13F和M13R进行菌落PCR鉴定阳性克隆。产品特点：⑴连接反应仅需5分钟。⑵适用于平末端PCR产物和带A尾的PCR产物。⑶载体采用了新的制备工艺，无需蓝白斑筛选。注意事项：⑴片段的选择：各种DNA聚合酶扩增的PCR产物。⑵引物要求：PCR引物5’端不能进行磷酸修饰，普通商业化引物即可。组成CL071-01CL071-02pBM16A-TOPOVector(20ng/l)20l20l×310×TOPOReagent20l20l×3ControlInsert5l5lM13F引物干粉管0.1OD0.1OD×3M13R引物干粉管0.1OD0.1OD×3操作步骤：1.连接反应按下表，在一个0.2mlPCR管中依次加入加完试剂后，轻轻混匀低速离心，使溶液集中在管底。注意：此步骤不要在低温条件下（冰水浴）上操作。2.反应温度及片段要求室温下（20-30℃）放置0-5分钟，然后将离心管放置在冰上。如当天不进行转化实验。请将连接产物置于-20℃保存。注意：DNA片段的用量见下表室温下（20-30℃）反应时间5-30分钟，如果室温较低，推荐使用PCR仪器控制温度。可以设置25℃反应5分钟。如果PCR产物电泳检测仅有很锐利明亮的条带，无引物二聚体和非特异性条带存在，可直接取0.5-1µlPCR产物原液进行克隆。3.阳性对照反应取1µl试剂盒提供的1kb长度的对照片段LacZ基因α肽片段进行克隆，转化具有α互补功能的大肠杆菌感受态细胞（如DH5α,TOP10,Mach1-T1等）。菌液涂布在含有IPTG,X-gal的LB氨苄平板上，次日蓝色菌落为阳性克隆，说明有片段插入，白色菌落为空载体。4.转化1.取5µl连接产物到50-100µl刚刚融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴2-30分钟。2.42℃水浴中热击30秒钟。成分体积DNA片段0.5-8µlpBM16A-TOPO载体1l10×TOPOReagent1l补水至总体积10l片段大小（bp）最佳用量（ng）100-100020-501000-200050-1002000-5000100-2003.立刻置于冰水浴中2分钟。4.加入300-500µl无菌的不含抗生素的SOC或LB，37℃，200-250rpm振荡培养60分钟。注：小于2kb片段可以不复苏，直接涂平板。5.吸取200µl菌液涂布。为了得到更多的菌落，可以先4000rpm离心1分钟，去掉部分上清，用移液器轻吹菌体，充分悬浮菌液，取全部菌液涂布，然后37℃培养过夜（12-16小时）。5.阳性重组子的鉴定菌落PCR（1）菌落PCR方法鉴定阳性克隆①用10l吸头挑选克隆至预先加有10μl无菌水或LB培养基的PCR管中，吹打混合。②25lPCR反应体系：取2μl细菌悬液为模板、加入5μM浓度的M13F/M13R各1μl进行PCR扩增。③PCR扩增条件：95℃预变性5分钟（裂解细胞，失活核酸酶），94℃变性10秒钟，55℃退火10秒钟，72℃延伸（根据片段的大小决定延伸时间，通常每1min/1kb）X秒，30个循环，72℃后延伸5分钟。1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，有强烈的明显条带的克隆为重组体，与插入片段大小相近（M13F/M13R引物在克隆位置的两侧，所以PCR扩增出的DNA的长度比插入片段大138bp）可视为阳性克隆。菌落PCR方法鉴定重组子时一定要设立一个不加菌液的阴性对照。（2）测序：用M13F、M13R通用引物对阳性质粒进行测序分析。6.pBM16A-TOPO载体图谱7.常见问题分析(1)重组子克隆菌少，或阳性率低：(2)感受态效率低，使用转化效率5×107cfu/µg的感受态细胞(3)连接反应在低温下（如放碎冰上）操作，应该在室温下操作。(4)PCR片段加入量太多或太少，按照推荐量加入。(5)PCR纯度低，重新扩增或重新纯化PCR产物。(6)PCR质量低，切胶时在紫外下照射时间长，需重新制备。(7)PCR扩增结束后，应该再延伸5-10分钟，确保片段延伸完全。(8)转化后没有复苏培养，可以加入SOC或LB，培养60分钟。(9)克隆基因可能对宿主菌有毒性，比如某些编码膜蛋白和DNA结合蛋白的基因，某些启动子和调节序列基因，或含有倒置或串联重复序列的基因，选用室温过夜培养平板，或换用低拷贝质粒载体。载体序列：pBM16A-TOPOAGTGAGTTGATTGTGTAAAACGACGGCCAGTGTCTGAGGCTCGCTTCAGTCCTGATGCTTGATATCCCGGGCGTGTCGCCCTT$$$$AAGGGCGACACGCCCGGGATATCGCGTCTGCCTGAAGTCAATACTGACGATGGTCATAGCTGTTTCCTGTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCACTTATTCCGTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGCTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAATGTAATCACCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCACCCGTGAAGGTGAGCC