ACE基因多态性

实验4颊粘膜上皮细胞基因组DNA抽提及ACE基因多态性检测[实验目的]掌握从微量来源的组织细胞中抽提基因组DNA，掌握PCR技术原理，了解基因多态性分析的方法。[实验原理]用碱裂解法抽提基因组DNA。以DNA为模板，用血管紧张素转化酶（angiotensinconvertingenzyme,ACE）基因特异的引物进行PCR扩增，根据PCR扩增片段的大小进行多态性分析。ACE基因第16内含子存在一种长度为287bp片段的插入/缺失（I/D）多态性，人类存在II、ID、DD三种基因型，其频率在人种间有差异。I/D多态性与循环ACE水平有明确的关系，DD型ACE水平最高，ID次之，II最低。ACE基因I/D多态性与左室肥大（leftventricularhypertrophy,LVH）的关系是：LVH者DD型频率明显增高。本实验引物序列位于287bp片段的两侧，扩增片段包括插入/缺失的片段，故II型扩增片段长度为490bp，DD型扩增片段长度为190bp，ID型扩增片段为２个，分别为190bp和490bp。图2.ACE基因的PCR扩增电泳图[操作]1.基因组DNA抽提(1)10ml溶液I漱口20秒,收集漱口水；(2)3000ｇ室温离心5分钟，弃上清；(3)250ul溶液II重悬沉淀；3000g离心1分钟，弃上清；(4)重悬沉淀于250ul溶液Ш，振荡10秒；(5)转移至0.5ml离心管，99℃加热5分钟；(6)用50ul溶液IV中和并振荡5秒；3000g离心1分钟去除细胞碎片，上清转移至0.5ml离心管，保留上清，5ul用于PCR.2.PCR反应(1)取消毒的0.5ml微量离心管，加入下列成分：混匀，加石蜡油2滴。（2）进行PCR扩增，扩增程序为：94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸40sec，共反应35个循环。10×PCRBuffer2.5μldNTP(2.5mMeach)2μlDNA模板5μl引物混合物(10μMeach)2μlddH2O13μlTaqDNApolymerase0.5μl总体系25ul（3）琼脂糖电泳检测：制备1％琼脂糖凝胶:0.5克琼脂糖溶解于50ml1XTBE电泳缓冲液，微波炉中加热2min溶化。稍等微温后，加入溴乙锭溶液2μl作为显色剂，混合均匀并灌制琼脂糖凝胶板。取10μlPCR产物，加入2μl加样缓冲液，上样并电泳，紫外灯下观察实验结果。注意：溴乙锭(EB)是DNA分子嵌合剂，可与DNA分子结合，在紫外光的照射下可发出橙色荧光。应当注意的是，溴乙锭具有极强的致突变能力，使用时必需谨慎。[试剂]溶液I:4%蔗糖：4g蔗糖溶于水，定容于100ml.溶液II:10mMNaCl和10mMEDTA(pH7.5):溶液III:50mMNaOH溶液IV:1.0MTris-HCl(pH7.5)PCR试剂盒：ACE基因上游引物：5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’ACE基因下游引物：5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’dNTPMix(10mM/each)TaqDNApolymeras10×Buffer[200mMTris-HCl(pH8.4),500mMKCl,20mMMgCl2]电泳缓冲液1×TBE：称取Tris54g,硼酸27.5g，0.5MEDTA20ml溶解，ddH2O定溶至5L。1％琼脂糖-TBE，石蜡油