细胞迁移和侵袭实验技术

肿瘤细胞运动实验技术肿瘤细胞生物学实验室张宁PI组体内实验：皮下移植瘤模型原位移植瘤模型肿瘤细胞运动体外实验肿瘤细胞运动常用研究方法Textinhere侵袭实验趋化运动划痕实验实验原理细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。划痕实验（伤口愈合实验，ScratchAssay）操作步骤1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线。操作步骤2.在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%；3.用10mltip枪头用力均匀地在培养皿中划痕，PBS洗涤2次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。操作步骤4．放入37℃5%CO2培养箱培养。每3h测量一次细胞运动的距离，拍照(具体时间依实验需要而定)。操作步骤5.数据处理：每个时间点的距离长度-0时距离=每个时间长度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差，时间为横轴，迁移距离为纵轴（单位mm）作图，并比较初始0时与实验结束时实验组与对照组的照片。注意事项1.在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（2%）否则细胞增殖就不能忽略。3.按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。4.实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同的细胞要观察细胞的贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。实验原理趋化运动是指细胞能够感受到外界化学物质的浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。趋化运动是一个非常保守的过程，对于生物体的生存、生命的繁衍等具有重要的意义。趋化运动实验（ChemotaxisAssay）微孔小室中的趋化实验微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计的。滤膜（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。BoydenChamber装置实验步骤1.在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的趋化因子置于趋化小室的下室，30ml/孔，每个浓度加3个孔，其中只加BM的孔为阴性对照；2.取对数生长期细胞，0.1%BM重悬细胞，调整细胞浓度为5×105/ml；3.加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平，光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上拧紧;在上室中加入细胞，50ml/孔，每个浓度加3个孔；实验步骤4.将趋化小室在37℃，5%CO2的孵化箱中孵育3h；5.在膜的两端加上夹子，毛面在PBS液面上蘸取，光面禁止碰到液体。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反复3次后再蘸取一次，晾干；6.固定,染色实验步骤7.取载玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蜡，盖玻片封片；8.显微镜观察计数，每孔至少3个随机视野，3个孔的数值取平均值;作柱状图，纵轴趋化指数或细胞数，横轴组别；9.趋化指数(ChemotaxisIndex)=随着趋化诱导因子的浓度梯度而迁移的细胞数目/用培养基做对照的迁移细胞数目注意事项1.膜，胶垫，上下小室之间防止有气泡产生；2.放膜时要对准位置，过多调整位置，易发生交叉污染。3.枪垂直，枪尖伸入孔中下大概4/5处，迅速加样，不要迟疑，打出液体的过程枪逐渐抬起，液体全部打出时枪尖离开液面。4.洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。scr#1#2#30204060801000110100***EGF(ng/ml)MDA-MB-231CellNumbers/HPF肿瘤细胞侵袭试验MatrigelInvassionAssayTranswell系统Transwell小室0.4um孔径聚碳酯膜的扫描电镜原理人工重构基底膜材料Matrigel，是一种细胞外基质，4℃时是液体，在37℃会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。滤膜孔径一般为8mm，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel的滤膜，这与体内情况较为相似。原理Transwell电镜图片实验步骤及注意事项1.无菌条件下Matrigel于冰浴融化，用PBS（或DMEMonly培养基）稀释成1mg/ml浓度，-20°C冻存备用；2.取出已稀释好的Matrigel，冰浴融化，以50ml的体积铺于Tramwell小室（24孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），37°C放置lh，使Matrigel聚合成凝胶（注意：加基质胶时最好将24孔板放置在冰盒上，确保胶完全覆盖孔底，不要有气泡）；3.每孔加入200ml1640（或DMEM）培养基使胶重构；4.在Transwell下室中加入趋化因子或10%FBS培养基600ml/孔；5.在上室孔中准确加入细胞l×105个/孔，细胞悬液体积200ml，置于5%CO2培养箱于37°C培养24h（注意：细胞量和时间根据实验条件摸索）；6.待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上未穿过膜的细胞；实验步骤及注意事项①Transwell小室②上层培养液③细胞④基质胶⑤下层培养液⑥细胞培养板Transwell侵袭实验示意图7.4%中性甲醛固定10分钟，Giemsa染色10分钟，PBS洗涤3次，干燥，取下微孔滤膜，倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞(200×)；8.每张膜中央部分和周围部分各随机取3个视野，计数每个视野内的穿过8mm微孔的细胞数。实验步骤及注意事项实验结果举例