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1目的基因的获取网址：NCBI，建议使用chrome浏览器。步骤：1在AllDatabase中输入已知基因名称2进入检索结果中Genes一栏进入seealso……在结果中任选一个进入……3找目的基因序列下拉至页面下端，进入genebank或fasta新页面下拉到底部出现目的基因序列4若要查找该微生物中其他序列则将该生物体的名称复制粘贴，并在genome数据库中查找，得出如下结果：下拉至底部，在dendrogram中找到该微生物。进入新页面，下拉到底部，进入如下Genomeregion即可得到该微生物的全基因序列。Ctrl+F可快速查找所需目的基因。2质粒上酶切位点的选择软件：Snapgene步骤：1.选定质粒载体，搜索得到质粒图谱，找出质粒的MCS(多克隆位点)区域及酶切位点。2.用snapgene分析目的基因序列，剔除部分酶切位点。3.结合图谱选择较短位点。即酶切位点前端的转录翻译部分越短越好，以免翻译出的蛋白质过多影响目的蛋白的性质。例:pET-28a中MCS酶切位点NcoI/NdeI/NheI/BamHI/EcoRI/SacI/SalI/HindIII/EagI/NotI/XhoInisA基因序列中经snapgene含有SacI酶切位点。则酶切位点就应在除SacI以为的其他酶切位点中选择。3引物设计引物格式：5-保护碱基+酶切位点+上下游引物-3①保护碱基提高酶切时的活性，使得酶切酶更容易结合，酶切更易进行。②酶切位点第2布中选择的酶切位点。③上下游引物上下游引物需要用primer5来设计。3.1上下游引物设计软件：Primerpremier5预读：PCR引物设计及软件使用前期：在NCBI找到自己所需的genesequence，选择ORF操作：New→DNAsequence→复制序列→primer→S/A(正反引物)→Edit→复制粘贴所选序列（S-Asis/A-Complement）→analysis→prime→分析参数（GC含量/Tm/Rating）→分析错误（Hairpin发夹结构/Diner二聚体/False错误引发）→OK保存。注:将引物序列保存至word参数与错误分析：1.上下游引物长度21-23bp，正反引物Tm相差不超过6℃，GC含量在40%-60%，Tm＞53℃，Rating（扩增效率）＞50%可行。2.引物末端最好是单独的G/C，GC同时出现易引发错配，AT不易P。3.发夹结构/二聚体/错误引发尽量调整为none，错误引发若3’端翘起（未出现错误）则可以不管。1000bp以内相差200bp可通过跑胶分析出来。？知识扩充:需要做突变时，首先设计未突变时的引物序列，再将突变处bp序列改变。正向引物：与扩增DNA序列5’→3’序列相同反向引物：与扩增DNA序列3’→5’序列反向互补（软件中已自动反向因此只用互补即可）①1个突变在突变处设计引物序列，将突变点放在引物序列的中间。以突变处为间断，分别设计两对引物。重叠PCR②2个突变在突变处设计引物序列，将突变点放在引物序列的中间。以2个突变处为间断，分别设计三对引物。3.2添加酶切位点在上下游引物前添加酶切位点，酶切位点的添加分以下几种情况：1位点上无起始密码子目的基因起始三个碱基构成起始密码子，一般为ATG/GTG。若位点上没有ATG，则可直接添加。2位点上有起始密码子①若起始密码子刚好在酶切位点最后三个，则将上下游引物首端起始密码子删除。例:酶切位点NdeICATATGniaA序列atgagtacaaaagattttaacttggatttg……则添加时为：保护碱基+CATATGagtacaa……（nisA序列起始三个碱基去掉）②若起始密码子在酶切位点中间，则将酶切位点后余下碱基补足，并删除上下游引物首端起始密码子。例:酶切位点NcoICCATGG其中ATG在位点中部，多出一个G。在酶切位点后添加碱基补足一个密码子，尽量使其翻译出的氨基酸较小。则应将酶切位点补上两个碱基变成：CCATGGCT。使得GCT编码氨基酸后，下一个氨基酸从目的基因开始编码，避免移码问题。3.3添加保护碱基保护碱基是为了让限制性内切酶更好的识别位点，并与酶切位点结合，提高酶切效率。保护碱基的添加应考虑碱基数目和碱基种类。各种酶切位点所需添加的保护碱基可参照保护碱基表。添加原则：一般而言，保护碱基至少添加4个，碱基顺序可随意，最好交叉，且一对引物前的保护碱基最好不同，以免导致错配。保护碱基含AT可降低Tm，含GC可提高Tm，可用保护碱基调整引物对的Tm值。尽量不产生发夹结构二聚体等。4引物检查与命名nisA序列中含SacI酶切位点。不含his-tag引物：（NcoI-BamHI）Forward:ATATCCATGGCTAGTACAAAAGATTTTAACTNcoIReverse:AATTGGATCCTTATTTGCTTACGTGAATACTABamHI4.1引物序列检查引物格式：5-保护碱基+酶切位点+上下游引物-3①保护碱基F/R的保护碱基序列应不同，碱基尽量交叉，碱基添加后与酶切位点不形成起始密码子ATG。②酶切位点是否含有起始密码子，与目的基因连接后是否会形成起始密码子。③上下游引物检查是否正确，末端是否为单独的G/C④起始密码子检查起始密码子所在位点。⑤参数检查用primer5中的editprimer或NCBI中blast检查整条引物的Tm值（53-）/GC%（40%-60%）/Rating（50-）4.2引物的命名一般以（姓名-序号）目的基因+酶切位点+F/R例:LY01-nisA-NcoI-F5引物合成在群里报备所需引物数目，填写相应公司订单并发送，等待收货。