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第五节基因芯片技术及其应用五十年代DNA分子结构和半保留复制模型的建立，六十年代基因编码的确定，七十年代限定性内切酶的发现和DNA重组技术的建立，八十年代PCR的发明，九十年代人类基因组计划的实施。分子生物学的发展推动了基因的研究1基因芯片的诞生生物科学正迅速地演变为一门信息科学。我们正由结构基因组时代迈入功能基因组时代。随着这个功能基因组学问题的提出（后基因组时代，蛋白组学），涌现出许多功能强大的研究方法和研究工具，最突出的就是细胞蛋白质二维凝胶电泳（2-D-gel）（及相应的质谱法测蛋白分子量）和基因芯片（Genechip）技术美国继开展人类基因组计划以后，于1998年正式启动基因芯片计划，美国国立卫生部、能源部、商业部、司法部、国防部、中央情报局等均参与了此项目。同时斯坦福大学、麻省理工学院及部分国立实验室如ArgonneOakridge也参与了该项目的研究和开发。英国剑桥大学、欧亚公司正在从事该领域的研究。世界大型制药公司尤其对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣，都已建立了或正在建立自己的芯片设备和技术。目前全世界有几百家基因芯片公司，有多种生物芯片问世，而且这些芯片的特点较以前密度更高，检测方法更精确，特异性更强的特点。而主要仍以少数几家公司为主，如Affymetrix、Brax、Hysep等。国内目前主要如清华大学（程京）、中科院生命科学院、上海复旦大学、北京军事医学科学院、南京东南大学、西安等四十余家公司，而且可能还有一大批公司相继成立。基因芯片是信息时代的产物横跨：生命科学、物理学、计算机科学、微电子技术光电技术、材料科学等现代高科技2.什么是基因芯片生物芯片，将大量生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特意性亲和反应，如核酸杂交反应，抗原抗体反应等来分子各种生物分子存在的量的一种技术。基因芯片（genechip），又称DNA微阵列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息。生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片。而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即将无数预先设计好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成点阵，与样品中同源核酸分子杂交的芯片。生物芯片的分类生物芯片的分类根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。根据探针的类型和长度，基因芯片可分为两类。其中一类是较长的DNA探针（100mer）芯片这类芯片的探针往往是PCR的产物，通过点样方法将探针固定在芯片上，主要用于RNA的表达分析。另一类是短的寡核苷酸探针芯片其探针长度为25mer左右，一般通过在片（原位）合成方法得到，这类芯片既可用于RNA的表达监控，也可以用于核酸序列分析。基因芯片1.元件型微阵列芯片①生物电子芯片②凝胶元件微阵列芯片③药物控释芯片2.通道型微阵列芯片①毛细管电泳芯片②PCR扩增芯片③集成DNA分析芯片④毛细管电层析芯片3.生物传感芯片①光学纤维阵列芯片②白光干涉谱传感芯片基因芯片的类型一般基因芯片按其材质和功能，基本可分为以下几类小鼠基因表达谱芯片(MGEC)目前国内基因芯片常见品种.(上海博星公司)癌症相关基因表达谱芯片(CRGEC)目前国内基因芯片常见品种.(上海博星公司)人类基因表达谱芯片(HGEC)目前国内基因芯片常见品种.(上海博星公司)6400点的基因芯片（面积12X14mm)核酸杂交技术是基因芯片应用的基础。3.基因芯片的原理基因芯片的基本原理任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8nt亚序列：这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。亚序列中A、T、C、G4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA的互补寡核苷酸序列。原理--通过杂交检测信息一组寡核苷酸探针—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由杂交位置确定的一组核酸探针序列GTTAGATC杂交探针组TATGCAATCTAG重组的互补序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATCATACGTTA基因芯片荧光标记的样品共聚焦显微镜获取荧光图象杂交结果分析探针设计杂交4.基因芯片设计一、基因芯片设计的一般性原则基因芯片设计主要包括两个方面:1.探针的设计指如何选择芯片上的探针2.探针在芯片上的布局指如何将探针排布在芯片上。确定芯片所要检测的目标对象查询生物分子数据库取得相应的DNA序列数据序列对比分析找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。数据库搜索•得到关于序列突变的信息及其它信息。在进行探针设计和布局时必须考虑以下几个方面：(1)互补性(2)敏感性和特异性(3)容错性(4)可靠性(5)可控性(6)可读性２、DNA变异检测型芯片与基因表达型芯片的设计对于DNA序列变异分析，最基本的要求是能够检测出发生变异的位置，进一步的要求是能够发现发生了什么样的变化。从杂交的单碱基错配辨别能力来看，当错配出现在探针中心时，辨别能力强，而当错配出现在探针两端时，辨别能力非常弱。所以，在设计检测DNA序列变异的探针时，检测变化点应该对应于探针的中心，以得到最大的分辨率。３、cDNA芯片与寡核苷酸芯片的设计cDNA芯片设计的关键在于数据库的建立和数据库信息的利用以及各种文库的建立。cDNA芯片制备方法一般采用点样法，多用于基因表达的监控和分析。寡核苷酸芯片制备一般采用在片合成方法。优化是寡核苷酸芯片设计的一个重要环节，包括探针的优化和整个芯片设计结果的优化。４、寡核苷酸探针的优化设计基因芯片布局杂交模式探针布局图TargetTCCGTTAGCTGACTGCAGCTTG变异5.基因芯片的制备基因芯片使用步骤芯片制作把探针固定于载体表面样品处理目标分子富集分子间的杂交结果检测与数据分析基因芯片的制作方式原位合成直接点样原位光蚀刻合成原位喷印合成分子印章法针式点样喷墨点样光导原位合成法1、原位光蚀刻合成寡聚核苷酸原位光蚀刻合成技术是由Affymetrix公司开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的5'羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5'端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含n个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。例如：一个完整的十核苷酸通过32个化学步骤，8个小时可能合成65,536个探针。目前美国Affymetrix公司已有同时检测6,500个已知人类基因的DNA芯片，并且正在制备含500,000-1,000,000个寡核苷酸探针的人类基因检测芯片。该公司每月投入基因芯片研究的经费约100万美元。该产品不仅可用于基因表达分析和基因诊断等，而且在大规模药物开发方面也具有诱人的前景。目前，用于分子诊断的DNA芯片不仅已可用于检测爱滋病病毒基因还可用于囊性纤维化（CF）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相关基因的基因诊断。鉴于光刻设备技术复杂，只能有专业化公司生产，加之成本高及合成效率不高的问题，因此有待进行以下研究：⑴对光刻技术进行改进，提高合成效率；⑵开发新的原位合成技术，如喷印合成技术，该技术既能进行原位合成又能进行非原位合成。2、光导原位合成法是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子（linker），其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographicmask）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羟基上的保护基团，游离羟基，利用化学反应加上第一个核苷酸，所加核苷酸种类及在芯片上的部位预先设定，所引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位点加上另外三种核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N个核苷酸长的芯片需要4N个步骤。每一个独特序列的探针称为一个“feature”，这样的芯片便具有4N个“feature”，包含了全部长度为N的核苷酸序列。这种原位直接合成的方法无须制备处理克隆和PCR产物，但是每轮反应所需设计的光栅则是主要的经费消耗。运用这种方法制作的芯片密度可高达106探针/平方厘米，即探针间隔为5－10μm，但只能制作II型DNA芯片。3、原位喷印合成芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不特殊制备的化学试剂。4、点样法点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。点样分子可以是核酸也可以是寡核酸。采用人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学处理后的载玻片上，经一定的化学方法处理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于载玻片上，制备好的DNA芯片可置于缓冲液中保存。用多聚赖氨酸包被固相支待物玻片，经过分区后用计算机控制的微阵列点样机按照预先设计顺序点上核酸分子，点样量很小，约为5nl。大规模CDNA芯片多采用这种方法，与其寡核苷酸微芯片相比。DNA芯片的潜在优越性是具有更强的亲和势和特异性杂交，但是需要大量制备，纯化，量化，分类PCR产物。1.玻璃片基的处理：使玻璃表面获得羟基、醛基、氨基等活性基团。2.点样针沾取探针溶液。3.点样针把探针点到玻片表面，让探针末端的化学集团与玻片表面的集团形成共价键。4.针式点样的优缺点优点：成本低，操作简单，密度高（几千-几十万点/cm2)，转移过程中探针溶液损失小。缺点：定量准确性、重现性不好针式点样生产商Bio-Rad性能介绍分辨率：1.25um(x，y轴)和0.25um(Z轴)，重复性：3um球面精确性：l0um。一次制成芯片数：126块芯片每块玻片点样量82,000个点2202芯片点样仪喷墨点样的方式类似于喷墨打印机。将合成用探针溶液放入打印墨盒内，由电脑依据预定的程序在xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动，并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的探针试剂（不足纳升）喷印到特定位点。喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。喷墨点样分子印章法根据阵列合成的要求设计并制作表面凹凸不平的分子印章，再按照合成的顺序，将寡核苷酸合成试剂涂布在不同的印章上，逐个依次压印到芯片特定位点进行合成反应。合成的后续反应与压电打印类似。分子印章法不仅可用于制备原位合成芯片，还可用于DNA微集阵列的制作。6.基因芯片样品制备DNA芯片进行实验包括5个过程生物学问题的提出和芯片设计；样品制备；生物杂交反应；结果探测；数据处理和建模。1．样品制备。一般所需mRNA的量是以一张表达谱芯片需要3μgmRNA计算的2样本采集过程关键点．氰代磷酸二乙酯(DEPC)1.离体新鲜组织，切成多个1cm3小块，剔除结缔组织和脂肪组织。胃、肠组织应剪除外膜；肝、肾、脾应剪除门部血管神经，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净（正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净）。2.在RNase-Free0.9％生理盐水中漂洗样品，