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转基因动物的制备方法1转基因动物的概念转基因动物就是指用试验的方法将人们所需要的外源基因导入到动物体内,使这种外源基因与动物本身的染色体整合在一起,这样外源基因就能随着细胞的分裂而增殖,在动物体内得到表达,并且能够稳定遗传给后代的动物。••转基因动物自产生以来,随着研究的不断深入,近些年来得到了迅速的发展。由于它打破了自然繁殖中的种间隔离,使基因能在种系关系很远的机体间流动,实现了动物种间遗传物质的交换与重组,这不仅为遗传物质的研究提供了新的手段,丰富了物种的基因库,而且扩大了生命科学的视野。•转基因动物是动物基因工程在医学生物学研究中的突出成果。•近十年来，为分子遗传学、发育生物学、医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的开发研究等多方面做出了很大的贡献。Gordon等人首次成功地将含有HSV和SV40DNA片段的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源DNA顺序的TGM。1982年Palmiter等运用此法得到的所谓“超级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等大小动物。从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传学、肿瘤学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的开发研究等。2转基因动物的制备方法2.1显微注射法•也称原核显微注射法，是发展最早、使用最为广泛的转基因方法之一。•利用显微操作技术将外源基因直接注射到试验动物的受精卵中，注射的外源基因与胚胎基因组融合，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有外源DNA片段。以使用较多的小鼠为例，这一方法的实验程序如下：•⑴准备假孕母鼠（养母）•⑵受精卵的准备•⑶基因导入•⑷胚胎移植•⑸对幼鼠的鉴定优点：外源DNA大小基本不受限制(1-50kb)导入过程直观整合率高缺点：设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性转基因沉默2.2精子载体介导法•将精子反复冷冻或经过化学物质处理后与外源DNA共同孵育,从而使外源DNA与精子结合,然后通过人工授精得到转基因个体•目前国际上极少成功模型，国内也很少有相关报道，精子载体法很少被应用。体外受精法&胞质内显微注射法•体外受精法是一种直接用精子作为外源DNA载体的转基因方法,其过程是将成熟的精子与外源DNA进行预培养,因为在一定条件下,精子核后帽区有自发结合DNA的能力,因此,精子能够携带外源DNA进入受精卵,并使之受精,从而使外源DNA整合到受体染色体中而得到转基因动物。2.3胚胎干细胞介导法•干细胞（stemcells）：是细胞谱系分化中最原始的细胞，能终身自我更新，并具有多分化潜能，能增殖分化为特定的组织细胞。•胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES）：从着床前的哺乳类胚胎中分离的多能干细胞，具有在体外不分化的增殖能力，经体外长期培养后仍具有分化成3种胚层的发育潜能。•通过一定的方法将外源基因导入到ES,外源基因通过随机插入或者同源重组的方式整合到ES基因组中,再以显微注射法把这种转基因胚胎干细胞植入正常发育的囊胚中,然后将囊胚移植到受体动物的子宫内,由于胚胎干细胞参与了胚胎生殖系的发育,所以所产生的嵌合体其生殖细胞中一部分细胞含有目的基因,将嵌合体连续与正常动物进行交配,就会得到转基因动物。ES细胞技术发展历史1956年，Whitten培养成功小鼠的受精卵，在体外发育成囊胚；1958年，McLaren经胚胎移植，体外培养的胚胎产生小鼠个体；1965年，Brinster建立了胚胎的微滴培养技术；1968年，Gardner将分离的细胞注入囊胚，获得嵌合鼠;1970年，Steven分离成功小鼠的胚胎瘤细胞；1981年，MartinEvans从正常的小鼠囊胚中分离成功ES细胞；1984年，Bradley证实注射入囊胚的小鼠ES细胞可分化为成体的各种组织，并整合入生殖系。意义：里程碑，与同源重组技术的结合使得在整体水平定向改变和修饰哺乳动物的遗传特性成为可能。1995年，Thomson从恒河猴中分离了猴的ES细胞；1998年，Thomson从人的囊胚中分离成功人的ES细胞；2000年，Bongso等建立了人的ES细胞株……优点：外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。缺点：ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体2.4逆转录病毒感染法•逆转录病毒是第一个用于基因转移的病毒载体。•将目的基因整合到逆转录病毒的RNA载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前或着床后的胚胎,RNA病毒感染宿主细胞后反转录成相应的DNA,并在整合酶和其末端特殊核酸序列的作用下整合到宿主细胞的基因组中进行表达和遗传得到转基因动物。与显微注射法的比较方式显微注射法逆转录病毒法DNA长度＜50kb,＜10-15kb,与时相单细胞卵4-6细胞卵移卵部位输卵管子宫整合方式随机，多拷贝随机，单拷贝表达受宿主旁侧的DNA影响受LTR影响易缺失传代可以有时不可以子代嵌合体机率高优点：受精卵携带外源基因的阳性率高外源基因多单拷贝整合操作简单，避免注射法对卵子的损害宿主范围广可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高。缺点：容纳大小有限；重组逆转录病毒的长末端容易甲基化，影响外源基因的表达。2.5体细胞核移植转基因法•近年来新出现的一种转基因技术。克隆绵羊“多莉(Dolly)”的诞生是转基因动物史上的一个里程碑。•先把外源基因与供体细胞在培养基中培养,使外源基因整合到供体细胞上,然后将供体细胞的细胞核转移到去核的卵母细胞组成重构胚胎,再把其移植到假孕母体,待其妊娠、分娩后便可得到转基因的克隆动物。核移植技术该技术源于用微细玻璃管对阿米巴原虫进行的核注射•1938年，Spemann提出了细胞核的全能性和将分化的细胞核移植到卵母细胞的设想；•1952年，Briggs和King将蛙胚胎细胞核注射导卵内，构建的重组胚胎发育成蝌蚪和蛙；•1962年，Gurdon证实已分化的细胞核可恢复其全能性；•1969年，开始哺乳动物的核移植研究；•1981年，Illmenser和Hoppe将小鼠胚胎内细胞团的细胞核植入去核的受精卵中，克隆出3只小鼠；•1986年，Willadsen等用未分化的胚胎细胞克隆出一只核移植绵羊；•1987年，Robl用胚胎细胞克隆出核移植羊；•1997年，Wilmut用成年绵羊的乳腺上皮细胞为核供体，克隆出绵羊Dolly。优点：对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以提高转基因的效率，不仅具有“ES细胞途径”的全部优点，且物种适用面广，无需经过嵌合体育种就可获得纯合个体，周期短，效率高。缺点：技术上难度大，成功率极低，胚胎死亡率高，非一般实验室可以开展。2.6人工酵母染色体(YAC)法•近年来发展起来的新型载体,具有克隆百万碱基对的大片段外源DNA的能力,可以保证巨大基因的完整性。•主要途径有:①胚胎干细胞转入YAC后体外筛选,阳性胚胎干细胞囊胚腔注射;②YAC原核注射。优点：保证大片段ＤＮＡ的完整性。保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率提高。保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性，因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。ＹＡＣ介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。除上述几种常用的转基因方法外，人们为了适应于一些特殊需要也探索了一些其他的方法。例如诱变技术(P265)等，这些方法都不太成熟，其应用也正被人们验证。参考文献[1]耿彩霞,狄冉,储明星.转基因动物的制备方法及应用评述.中国畜牧兽医,2010,37(6).[2]韩堃,刘东军.细胞核移植技术的发展及其应用.中国生物制品学志,2007,20(6):467~470.[3]王凌云,成功,周欢敏.动物转基因研究中的技术方法.生物技术通报2010,12:73~77..参考文献[4]陈锡文,管敏强,吴步猛.转基因动物技术的基本方法和应用.2004:119~123.