第9章转基因动物与动物生物反应器

第9章转基因动物与动物生物反应器一转基因动物的制备方法二转基因动物的应用三乳腺生物反应器四基因打靶转基因动物基因工程技术胚胎工程技术•转基因动物（transgenicanimal）是指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。转基因动物转基因动物的命名原代转基因动物:founderG0G1G2拟人化命名伦理问题人类在认识自然改造自然上的巨大进步潜在的危害1982年,Palmiter生产超级小鼠世界上第一只转基因动物:转入了生长激素基因的巨鼠（supermouse）哺乳动物转基因技术的主要环节1目标基因克隆和体外重组2外源基因的导入3外源DNA整合、转录及表达的分子检测4转基因动物品系或品种的建立哺乳动物生殖生理哺乳动物受精和妊娠，整个过程都在母畜体内进。一转基因哺乳动物的制备方法显微注射法逆转录病毒载体感染精子载体介导法胚胎干细胞介导法体细胞克隆技术精原干细胞介导法YAC介导的基因转移???1显微注射法MicroinjectionintothePronucleusofaBovineZygote受精卵显微注射胚胎移植后定检测显微注射法操作流程视频a、转移率较高、整合效率达20%；b、外源基因长度可达数百Kb；c、可得纯系动物；d、周期相对较短。显微注射法的优点a、设备昂贵、操作复杂；b、随机整合、首尾相连的多拷贝；c、转基因效率较低，约0.5%-3%;d、常造成插入位点附近宿主DNA大片段缺失、重组等突变，出现动物严重生理缺陷。缺点2．逆转录病毒载体感染法原理：当逆转录病毒的RNA进入细胞后，逆转录成DNA，依靠逆转录病毒的整合酶及其末端特异的核苷酸序列，DNA前病毒可整合到染色体上，从而将其所携带的外源基因插入到染色体上。逆转录病毒载体•逆转录病毒感染法特点优点：在各种转基因方法中，逆转录病毒感染法的转基因效率是最高的，且为单拷贝随机整合。缺点：逆转录病毒载体在设计时虽然缺失了病毒的复制功能序列，但是复制大量载体DNA所需的辅助病毒基因组内有可能与目的基因一起整合到同一细胞核中，就可能大量复制病毒，造成严重的污染，故不安全。此外，逆转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA（≦10kb），而且逆转录病毒长末端重复的甲基化状态常使转基因的表达缺失。3精子载体法1989年,Lavitrano等将质粒与小鼠的附睾精子，在等渗溶液中共育30min后进行体外受精和移植，产生转基因阳性小鼠并能遗传给后代。Rottman等对上述精子载体法进行了改进，其将外源DNA用脂质体包埋，再与鸡精子共同孵育，然后人工受精取得成功。Anthony等尝试了一种新的方法，预先将小鼠的精子进行破膜处理，再与外源基因共孵育1min，然后将精子头部显微注射入MⅡ期的小鼠卵母细胞，获得成功。该项研究揭示，精子膜破损后外源DNA穿过外膜吸附于内膜,更有利于转基因动物的产生。精子与外源DNA结合的机理•Smdrdora(1998)的研究结果表明。只有附睾精子和经洗涤去精清的精子才能有效地携带外源DNA，这说明精浆中某种因子强烈抑制外源DNA的结合。这些因子可能直接作用于DNA分子，也可能竞争结合在精子表面的结合部位而间接起作用。促进DNA与动物精子结合的方法1共孵育法2电穿孔法3脂质体法精子载体法？？？？•别人无法重复4、胚胎干细胞法获得功能基因构建基因打靶载体转染胚胎干细胞获得基因剔除细胞系制备嵌合体筛选进入生殖系小鼠转基因小鼠（F1）表型分析选择单系同胞交配产生（F2）代筛选纯合子的转基因小鼠胚胎干细胞法建立转基因鼠的实验程序与传统育种方法相比较，ES细胞在生产转基因动物方面表现其独特的优势：（1）打破了物种的界限，突破了亲缘关系的限制，加快了动物群体遗传变异程度；（2）可以进行定向变异和育种，利用同源重组技术对ES细胞进行遗传操作，通过细胞核移植生产遗传修饰性动物，有可能创造新的物种；（3）利用ES细胞技术，可在细胞水平对胚胎进行早期选择，这样可以提高选择的准确性，缩短育种时间。近年来的研究表明，利用ES细胞生产转基因动物在动物生产中发挥着极为重要的作用。基因打靶5体细胞克隆转基因技术平台ClonedsheephashumangenePOLLYDOLLYKorea：Productionoftransgenicclonedpigs•transgenicclonedpigswiththegreenfluorescentprotein(GFP)onJune8,2003.导入人乳铁蛋白转基因的克隆奶牛2005年初在唐山降生6精原干细胞介导法generationoftransgenicratsWhichgenetransfertechniqueinvolvesatinyneedlewhichisusedtoinjectDNAintoacelllackingthatDNAsequence?•A)spermatogonialstemcellstransplantation•B)liposometransfer•C)microinjection•D)genetargetingofembryostem(ES)cells√Geneticengineeringmanipulatesgeneproductsatthelevelofthe•A)protein.•B)aminoacid.•C)DNA.•D)RNA.√转基因鸡现在的工作：转基因鱼二转基因动物的应用•（1）动物品种改良；•（2）生物制药(乳腺生物反应器)；•（3）建立人类疾病的动物模型；•（4）生产可移植用的动物器官；•（5）基因治疗(动物模型)；•（6）基因打靶。（1）动物品种改良抗病育种生长性状（2）生物制药(乳腺生物反应器)如荷兰的GenPharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元。（3）建立人类疾病的动物模型已建立的部分人类疾病的转基因动物模型_____________________________________________疾病模型基因转移方法转导的基因______________________________________________________老年性痴呆征显微注射β淀粉样蛋白基因Ⅱ型糖尿病显微注射胰岛淀粉样多肽基因β地中海贫血症显微注射人β珠蛋白基因镰刀形细胞贫血症显微注射人α和β珠蛋白基因唐氏综合症显微注射Cu/Zn-SOD酶基因卡氏肉瘤反转录病毒转染HIVtat基因成骨不全症显微注射突变的α1胶原蛋白前体基因自毁容貌症ES细胞同源重组突变HGPRT基因_____________________________________________4）生产可移植用的动物器官•我国每年有150万人需要器官移植，但是仅仅不到1万人能够得到供体。•猪的脏器移植给人，会发生超急性排斥反应。•转基因技术生产能降低或掩盖半乳糖基转移酶活性的转基因猪。•如何用细胞工程解决移植器官的来源问题?Science(2002).295,1089–1092（5）基因治疗•上世纪九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脱氨酶)基因缺陷导致严重免疫缺损的四岁女孩，由美国国立卫生研究院用ADA基因治愈。“基因治疗”研究热从此波及全世界，起而效颦，为保障人类健康展现了美好的前景。（6）基因打靶•基因打靶(Genetargeting)是一种在胚胎干细胞(ES)技术和同源重组技术的基础之上,定向改变生物活体遗传信息的实验手段。基因敲除(geneknockout)：定向敲除基因敲入(geneknockin)：定向替代基因打靶的研究意义基因功能研究人类疾病动物模型的研制经济动物遗传物质的改良三个主要环节打靶载体的构建靶细胞转染与筛选由中靶细胞制备转基因动物基因打靶技术•根据打靶细胞的不同，基因打靶主要分为:1胚胎干细胞介导的基因打靶技术2体细胞克隆介导的基因打靶技术3精原干细胞介导的基因打靶技术胚胎干细胞介导的基因打靶技术•首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。通过显微注射将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。体细胞克隆介导的基因打靶技术家畜的体细胞克隆技术已取得突飞猛进的发展，为转基因动物的生产提供了一条新途径。直接在体细胞中进行基因同源重组，体外筛选中靶细胞，再以之为核供体获得转基因后代，是当前家畜基因打靶的一条有效途径。但是，由于体细胞体外培养的有限性和同源重组概率低，使体细胞克隆途径的基因打靶效率比胚胎干细胞途径大为降低。精原干细胞介导的基因打靶技术•日本研究人员Kanatsu-Shinohara等（2006）首次利用SSCs技术平台进行了基因打靶研究。他们构建了封闭蛋白Occludin基因敲除载体，电穿孔法转染体外培养的小鼠SSCs，经过筛选，获得了二株中靶SSCs集落；再选择一株中靶SSCs移植进不育小鼠曲细精管内能够重塑精子发生并产生了杂合后代，杂交后获得了纯合的基因打靶后代。基因打靶的必备条件•胚胎干细胞(ES细胞)–能在体外培养，保留发育的全能性•打靶载体–Neo（新霉素）阳性筛选标志–HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)基因敲除的基本程序打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞：重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种同源重组同源重组(Homologousrecombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程,外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。（6）基因打靶正负双向选择系统(positive-negative-selection,PNS)•同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk）。•胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。故同源重组时，G418和GANC都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死，无整合的将被G418杀死。用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策略。正向筛选标记基因Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。实验流程Genetargetingisdoneona(an)•A)spermcell.•B)eggcell.•C)fertilizedovum.•D)embryonicstemcell.√应用举例肌肉生长抑制素基因Myostatin基因敲除•Myostatin基因是一种特异性骨骼肌生长发育的抑制因子。该基因与动物骨骼肌总量的调节有关，其序列在进化过程中高度保守，所有哺乳动物和鸟类均有很高的同源性。Myostatin基因在功能上也是非常保守的，其功能的缺失会造成可导致肌肉异常肥大。比利时蓝牛肌肉增加表型皮埃蒙特牛肌肉增加表型双肌左图为德国“娃娃超人”未满月时的照片，右图为他7个月时的照片。白色和