20141008常规病理染色技术

常规病理染色技术云南省第三人民医院病理科徐开军Page2病理制片的质量直接影响病理诊断的准确性Page3HPV16抗酸染色要求：①各步骤流程合理②规范化的技术操作③高度的责任心HE染色Page4染色中的基本原则一、染色前的处理（脱蜡至水）石蜡切片须经二甲苯脱蜡、梯度乙醇至水洗。二、染色苏木精染细胞核、分化、蓝化、伊红染细胞浆三、染色后的处理（脱水透明）1.染色后的脱水：由低浓度向高浓度乙醇逐级过度，保证脱水彻底。Page52.脱水后的透明四、封固1.甘油明胶封固剂：脂肪染色的标准封固剂。2.中性树胶封固剂：最常用封固剂。Page6染料具有染色能力须具备的条件：①本身具有颜色，即其分子结构中要含发色团。②与被染组织有亲和力，即其分子结构中要含有助色团。同时具备这两个条件的化合物才能做染料掌握常用染色原理一、染料的性质Page7苏木精被氧化呈苏木红苏木红与媒染剂结合（一）苏木精染色原理铝-苏木红色淀与胞核内磷酸根结合Page8水溶性伊红Y在水中离解伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞质、红细胞、结缔组织等物质染成不同程度的红色或粉红色。（二）伊红染色原理Page9（三）苏木精的氧化1.自然氧化（成熟氧化）暴露在阳光和空气中，这个过程比较缓慢，约需3-4个月，但染液可使用较长时间。2.化学氧化采用氧化剂（如氧化汞、碘酸钠、高锰酸钾等）使染液立即被氧化成熟。这种苏木精配制后即可使用。化学氧化苏木精较自然氧化的寿命要短。Page101g苏木精所需氧化剂的量：氧化汞100mg碘酸钠40-100mg高锰酸钾90mg高碘酸钠35mg碘200mg高碘酸钾50mgPage11在几种氧化剂中，碘酸钠为首选氧化剂，其优点是在室温下易溶于水，无需加热，稳定性好。理论上，1g苏木精（3水）被完全氧化成苏木红需要185mg碘酸钠。1g苏木精（无水）被完全氧化成苏木红需要218.2mg碘酸钠。在实际配制苏木精染液时，常用半量碘酸钠，目的是先使部分苏木精氧化成苏木素，染液中未被氧化的苏木素在染液保存和使用过程中慢慢被完全氧化。Page12苏木精属于进行性染色还是退行性染色，是由苏木精染液内苏木素的浓度和被氧化程度而定。1.进行性染色：苏木精染色后，组织和细胞的不同部分深浅恰如其分地被显示出来，无须分化。2.退行性染色：先将组织过染，再用分化剂有选择性去掉不该着色的部位。Page13（四）苏木精的媒染剂苏木精被氧化成酸性染料苏木红后，仍不具有染色力，需与媒染剂结合，形成带正电荷的蓝色色淀，才能与细胞核结合而完成染色。媒染剂的多为二价或三价的金属盐如铝盐和铁盐，少数特殊苏木精也有采用铁等。常用的媒染剂有：硫酸铝钾（钾明矾）、硫酸铝铵（铵明矾）硫酸铁铵（铁明矾）、硫酸铝、三氯化铁Page14苏木红与铝盐结合形成蓝色色淀（Harris苏木精）苏木红与铁盐结合形成黑色色淀（Weigert铁苏木精）色淀与细胞核结合牢固，水、乙醇都难以洗脱，有利于苏木精染液的对比染色，且在完成染色后经脱水、透明、封固过程不容易脱色。Weigert铁苏木精染液作为耐受分化和用较强酸性染料做复染的首选细胞核染料。Page15（五）苏木精染液配制试剂作用1.无水酒精：溶解苏木精，抑制真菌生长。2.碘酸钠（钾）、氧化汞：氧化剂，使苏木精经过氧化后变成苏木红。3.硫酸铝钾、铵、铁：媒染剂，其中三价铝离子与苏木红结合形成蓝/黑色的色淀，与细胞核内核酸的磷酸根牢固结合而着色。Page164.甘油：稳定剂，防止苏木精在空气中不断氧化，延长染液的使用时间。5.冰醋酸、柠檬酸：抵消氧化剂的氧化作用，使苏木精与苏木红保持均衡。同时又可增加细胞核的选择性染色，使细胞核染色质显示清晰细致。1g柠檬酸=20ml冰醋酸。（醋酸比例一般为染液3%-5%的量比例）Page17（六）影响苏木精氧化的因素1.酸碱度：染液偏碱性氧化快，中性时稍慢，酸性时较慢。染液内加酸（冰醋酸或柠檬酸）可延缓氧化作用。2.氧化剂的量：加入氧化剂后苏木精可立即被氧化成熟可用。3.温度：碘酸钠作为氧化剂时，在常温下加入即可，氧化汞作为氧化剂时，需煮沸苏木精加热才能起到氧化作用。Page18（七）配制后苏木精染液的判断1.采用组织进行预染色。Page192.将几滴苏木精染液到自来水中：①不散开且仍保持红色:未足够成熟②一瞬间由红色转变为紫蓝色慢慢扩散:成熟且质量好③很快散开呈蓝色:已经失效Page203.将苏木精染液滴在滤纸，染液在滤纸上扩散片刻，外周呈紫蓝色，中心呈紫红色圆斑：质量好的染液。周边不呈紫蓝色：染液不成熟或没有配制好。Page21（一）Harris苏木精传统、经典的经氧化汞化学氧化成熟的明矾苏木精。属于退行性染液。染液对细胞核着色较深，染色约5分钟左右。适用于常规HE、细胞学等染色。二、苏木精染液的性质Page22组织学、细胞学染色Page23不足之处：配制烦琐、需加热煮沸，氧化时间不易控制，氧化汞有毒。染液表面常形成一层金黄色氧化膜而污染切片。染液所用的硫酸铝钾量也较多，但随着时间推移和（或）温度降低会有结晶析出及沉淀产生。可减少硫酸铝钾的用量，氧化汞换成碘酸钠。Page24（二）改良Lillie-Mayer苏木精苏木精5g无水乙醇50ml硫酸铝钾50g蒸馏水650ml碘酸钠500mg甘油300ml冰醋酸20ml染液短时间内无氧化膜形成，使用时间长，细胞核染色质着色较深细微。染色时间在3-5分钟即可。Page25（三）伊红(曙红)人工合成染料。桃红色或粉红色的粉末。伊红是由荧光素衍生而来，有多种，常规病理染色中，主要是水溶性伊红Y和醇溶性伊红Y。常用浓度0.5%-1%。微量醋酸（1000ml染液中加入0.5ml）可增强着色。常规病理染色中不采用伊红B染色。Page26水溶性伊红YY：代表黄色,化学名称为四溴荧光素二钠盐，其分子内含溴愈多，颜色愈红。醇溶性伊红Y:称为四溴荧光素,易溶于酒精,不溶于水。水溶性伊红B又称蓝光伊红，二溴二硝基荧光素二钠，易溶于水。醇溶性伊红B又称醇溶伊红B，溶于乙醇。伊红B略带蓝色，与蓝色的苏木精对比染色不理想，Page27水溶性伊红配制简单，最为常用。但染液使用一久后易长真菌而污染切片及出现沉淀，需经常过滤。染色后需要流水稍洗再进行脱水。（水洗及低浓度酒精脱水均有分化作用。）醇溶性伊红染色可不经水洗直接进行乙醇脱水、二甲苯透明和封片。较常用0.5-1%水溶性伊红，染色时间为2-5分钟。Page28三、分化与蓝化分化目的：酸能破坏苏木精的醌型结构。用盐酸乙醇将细胞核中结合过多的染料、细胞质中吸附的染料及不需要着色的部位离解，以利于伊红的进一步染色。分化控制：分化液的新鲜程度和浓度决定分化时间。①新配制、高浓度分化液分化时间要短一些，反之分化时间要长一些；②苏木精染色时间久分化的时间要长一些，反之分化时间要短一些。Page29返蓝目的：蓝→红→蓝过程苏木红与Al3+形成蓝色色淀的结合、离解和再结合的过程。蓝色色淀在酸性环境处于离子状态，呈红色（色淀离解）；红色离子状态的色淀，在碱性/中性环境中处于结合状态，呈蓝色（色淀形成）。返蓝控制：通常用流动自来水冲洗10-15分钟。若用碱性蓝化液可缩短时间，但蓝化后也需流水冲洗2-3分钟。Page30分化液：0.5ml浓盐酸+99.5ml70%酒精蓝化液：1g碳酸锂+100ml蒸馏水0.3ml浓氨水+99.7ml蒸馏水Page31四、常规HE染色流程Page32细胞核呈蓝色，细胞质、肌纤维、胶原纤维、和红细胞呈不同程度的红色。Page33细胞学HE染色Page34五、HE切片的规范技术标准质量标准满分（分）质量缺陷减分1切片完整15①稍不完整：减1-7分②不完整：减8-15分2切片厚薄均匀15①厚薄不均：减3-6分②切片厚，影响诊断：减7-15分3切片无刀痕、无皱褶、无颤痕15①有刀痕、皱褶、颤痕尚不影响诊断：减2-7分；②影响诊断：减8-15分。4切片无污染15有污染物：减15分5切片染色对比清晰、红蓝适度、透明度好20①细胞核着色灰淡或过蓝：减4分；②红蓝对比不清晰：减4分③透明度差：减1-4分；④组织结构不清：减5-8分6切片封胶适中、无气泡，洁净10①封胶外溢：减3分②有气泡：减3分③切片不洁净：减4分7切片标签端正牢固，编号清晰10①标签粘贴不端正及牢固：减3-5分②编号不清晰：减5分合计100切片质量分级标准：1.甲级片：≥90分（优）2.乙级片：75-89分（良）3.丙级片：≥60-74分（基本合格）4.丁级片：≤59分（不合格）Page35六、冰冻切片染色流程1.取材后组织放臵标本托，立即放到冰冻切片机速冻台，添加包埋剂放上冷冻锤。（1-2min）2.将冻好的组织移到切片机夹头内夹紧，修片至适度面，即可切片，切好的组织薄片（4-8um），黏贴在编号的载玻片。（1-2min）3.立即固定（95%酒精/甲醇-冰醋酸)。（30s-1min）4.改良Carazzi苏木精染色。（50s-1min）5.稍水洗，碳酸锂水溶液蓝化。（15s）6.1%水溶性伊红染色。（15s）7.稍水洗，80%酒精、95%酒精Ⅰ、95%酒精Ⅱ、无水酒精Ⅰ、无水酒精Ⅱ逐级脱水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明。8.中性树胶封固，贴附标签。Page36子宫内膜腺体肺腺癌Page37子宫肌瘤乳腺导管Page38冰冻切片质量要求1.操作流程规范、速冻及固定及时2.切片完整、厚薄均匀、无皱褶、无刀痕、无冰晶3.染色核浆分明、红蓝适度4.组织透明度好、封裱美观5.单件标本冰冻切片制片总时间在15分钟内Page39冰冻切片几个细节问题1、速冻冷冻切片的关键环节，减少冰晶产生。速冻的关键在于：①组织取材厚度适宜②冷冻切片机冷台的设臵③速冻锤的正确应用④包埋剂的量⑤切片的速度Page40冷冻的速度Page412、固定：防止细胞退变。切片后立即固定。切记勿采用电吹风或酒精灯加热固定。95%酒精或甲醇固定细胞收缩小、作用快、染色清晰、对比鲜明。Page42固定的速度Page431、切片要求2、染色要求1、组织脱水、包埋2、组织切片、染色1、试剂管理2、设备维护试剂、设备影响因素质控要求结果（七）HE制片质量控制质量控制是保证正确病理诊断不可缺少的重要环节Page44（一）常规HE制片质控要求1.切片完整、厚薄均匀，无刀痕、无皱褶组织包埋面按有病灶的一面向切面包埋胃肠道等管腔组织应有层次、小组织各块切全厚度为3-5um为宜，淋巴结组织稍薄切片刀需锋利，展片水温适度（石蜡熔点减15°C）2.贴片位臵恰当“定点”“定向”Page45面部包块临床诊断：面部痣？两个不同包埋面结果最终病理诊断：基底细胞癌Page463.染色核浆分明、红蓝适度4.无污染组织污染是制片的禁忌5.封片采用湿封片6.封片无气泡、胶不外溢封片树胶适量，浓度适中7.切片标签端正、编号清晰Page47关于封片切片经过酒精脱水、二甲苯透明后必须湿封片。如干封片，切片会出现黑色结晶样黑点（胞核炭化）。伊红染色后或脱水后直接吹干会出现细胞核收缩、龟裂，细胞收缩，组织间隙增加，透明度差。Page48不同封片Page49（二）影响HE制片因素1.组织脱水、包埋①取材：组织取材大小适度。②固定：充足、及时、固定液的量。③脱水：彻底、时间的控制。低浓度酒精脱水可延长。④透明：透明宜充分，不过度。一般60-90min。⑤浸蜡：一般2-3小时。⑥包埋：组织包埋面正确，优质的包埋石蜡。每个环节衔接恰当Page50脱水严重不足：无法切片Page51固定、脱水问题：细胞核不上色Page52胎盘组织固定、脱水不当经过处理的组织：染色核染色尚可。固定不足：染色之前AFA液固定10-20分钟脱水不足：重新进行脱水Page53良好的固定、脱水是淋巴结制片的关键Page54包埋Page55鳞状上皮乳头状瘤：包埋面的选择Page562.切片①切片薄而平整、完整，关键在于切片刀的锋利和组织的处理、包埋。②展片无皱褶，水温适度，水的清洁。二次展片。③贴片“定点”和“定向”。④烤片温度和时间，65度30-60min。P