RNA干扰shRNA原理及设计

RNA干扰/shRNA原理及设计RNAi概述：RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencingandtransgenesilencing)。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。RNAi基本原理示意图：RNAi类别：1、siRNA合成：原理：在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。化学合成的siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。2、microRNA干扰载体构建：原理：载体采用PolII启动子表达人工设计的微小RNA(miRNA),后者从长的转录本被加工，进而导致特异性的mRNA的降解。3、shRNA干扰载体构建：短发卡RNA(shRNA)是可以克隆到表达载体并表达短的干扰RNA(siRNA,19-21个核苷酸的RNA双链)的DNA分子。我们可根据靶标设计短发卡RNA(shRNA)序列并将其克隆到特定载体上。4、慢病毒RNAi：原理：慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动物制备。利用慢病毒构建的shRNA/miRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirus－shRNA/miRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。5、腺病毒RNAi：原理：腺病毒（adenovirus，AV）是一种没有包膜的线状双链DNA，它能感染分裂细胞和非分裂细胞，在核内以神经元细胞的形式复制，存在多种AV血清型。到目前为止，构建的绝大多数载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方法取代E1或E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在表达高水平E1和E3基因的细胞中复制，因此适合应用于治疗的高效控制系统。腺病毒载体能够高效传递和表达基因的能力（尤其是在体外），由于具有宿主范围广，对人致病性低；在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；能有效进行增殖，滴度高；与人类基因同源；不整合到染色体中，无插入致突变性。对于难转染的细胞，如原代或非分裂细胞，采用病毒递送miRNA/shRNA的方式是非常有效的选择。几个概念的区分：shRNAs(RNA-ShorthairpinRNAs)：即短发夹RNA，是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，可通过RNA干扰来抑制基因的表达。ThomasRosenquist和GregHannon小组联合研究了在哺乳动物种系细胞中shRNAs的转移导致基因长时间稳定沉默的机制。microRNA（miRNA，微小RNA）是由内源性发夹（hairpin）结构转录产物衍生而来的一种长为19nt~25nt的单链RNA。在每种高等动物中，存在200种以上的miRNA，是最大的基因家族之一，约占基因组的1%。siRNA：(short/smallinterferingRNAs)：即小干扰RNA，是一种短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径（RNAinterferencepathway）miRNA，siRNA，dsRNA和shRNA都是RNA干扰技术中用到的小分子RNA，其不同之处在miRNA是单链RNA，其余均为双链RNA；siRNA和dsRNA相似；shRNA需通过载体导入细胞后，然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用。miRNA与shRNA图示：