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Westernblot实验技术Westernblot原理WesternBlot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质混合物，经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗体起反应，经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之SDS後,由於SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致(chargedensity),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵(时间)Tris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份分子筛效应凝胶浓度，凝胶孔径↓，机械强度TEMED促使AP形成氧自由基，进而催化Acr单体为长链，Bis再使长链彼此联成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶（PAG）。AP-TEMED系统单体：丙烯酰胺（Acr）交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）催化剂：过硫酸铵（AP）诱发剂：四甲基乙二胺（TEMED）氧自由基聚丙烯酰胺凝胶注：O2为终止剂-+上样缓冲液（Loadingbuffer）浓缩胶分离胶Tris/HClpH6.8Tris/HClpH8.8[Tris-HClpH6.8;甘油；SDS；巯基乙醇；溴酚蓝]转膜缓冲液（transferbuffer）[tris-HCl;glycine]电泳缓冲液（runningbuffer）[tris-HCl;glycine;SDS](Acrylamide;bis;SDS;AP;TEMED)SDS-PAGE“两胶三缓冲”sample电泳三离子：glycine-Cl-Protien-SDS----------------带负电的蛋白胶束“消除电荷差、构像差”-+浓缩胶分离胶pH6.8pH8.8SDS-PAGECl-电泳三离子：glycine-Cl-Protien-glycine-protein-HCl全部解离成Cl-，迁移最快，走在最前----“先导离子”甘氨酸仅有0.1～1%解离成Gly-，迁移最慢，走在最后---“尾随离子”重点理解：先导快离子后方----离子强度----低电导区---电场强度，使glycine和protein加速移动。蛋白样品受“夹板气”，被“压缩”，达“稳态”浓缩胶分离胶甘氨酸大量解离，迁移加快，走在蛋白前，跟着Cl-跑了。样品蛋白在均一的电场强度和PH中“尽情”泳动根据样品成员的分子大小，不同的迁移率，实现分离（分子越小，跑得越快）Cl--glycine-protein-小分子大分子中分子高E低E压缩,分离效应大致流程提取与处理样品蛋白电泳分离样品蛋白转移蛋白至杂交膜封闭非特异性位点一抗孵育洗涤二抗孵育洗涤底物显色或曝光检测E鼠兔固相载体人源目的蛋白兔源二抗(抗鼠Fc段)鼠源一抗HRP明确蛋白样品的来源（组织；细胞；体液）选择适当的裂解方式（研磨；超声；剪切；冻融等）选择适当的裂解buffer（SDS；RIPA；NP-40；商品化试剂盒）加入合适的蛋白酶抑制剂（Aprotinin；PMSF；leupeptin;pepstantinA;PIC;EDTA；EGTA）蛋白样品提取问题蛋白位置推荐buffer全细胞NP-40orRIPA胞浆（可溶性蛋白）Tris-HCl胞浆（骨架结合蛋白）Tris-Triton膜蛋白NP-40orRIPA核蛋白RIPAor核蛋白提取试剂盒线粒体蛋白RIPAor线粒体分离试剂盒1.浓缩、纯化、脱盐:①离心；②超滤;③透析;④冻干。2.变性样品:a)SDS：阴离子表面活性剂----①断开氢键；②取消疏水作用；③去除多肽折叠；④屏蔽蛋白电荷量。b)高温：①95~100℃,5~15min（大多数蛋白）；②70℃,5~10min（多次跨膜蛋白）3.还原样品:a)β-巯基乙醇：强还原剂---断开二硫键,破坏二三级结构b)二硫苏糖醇(DTT):还原剂---断开二硫键,破坏二三级结构蛋白样品处理问题蛋白样品处理问题待测蛋白状态凝胶条件上样buffer电泳bufferReduced-Denatured还原，变性含β-巯基乙醇或DTT，含SDS含SDSReduced-Native还原，不变性含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS不含SDSOxidized-Denatured不还原，变性不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS含SDSOxidized-Native不还原，不变性不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS不含SDS根据目的蛋白的状态确定电泳条件：抗体识别蛋白的空间型抗原表位时，不可加热及SDS变性抗体识别蛋白的氧化状态时，就不可加还原剂（β-巯基乙醇或DTT）胶类型的选择：PAGE、SDS-PAGE、tricine-SDS-PAGE、IEF、2D胶的浓度选择：蛋白大小、数目、个人经验配胶时间：忌即配即用（防凝固不均）；忌长期冰箱放置（防SDS结晶）；保存≤4天（防SDS水解聚丙烯酰胺）配胶温度：室温或37℃配胶试剂：AP：现用现配或分装冻存TEMED：最后加,边加边晃Tris-HCl:上下胶pH勿混(上6.8/下8.8)丙烯酰胺:神经毒性配胶问题蛋白分子量（ku）凝胶浓度（％）4-402010-431512-601220-801025-200857-2125蛋白上样问题上样的总蛋白量根据蛋白表达丰度及研究目的调整适当的蛋白上样量（①20-70ug细胞/组织裂解液；②100ng纯化蛋白；）上样的总体积1~30ul(小板)；1~５0ul(大板）各孔上样量一致每孔上样量尽量保持一致，以防条带倾斜．上样孔的选择忌烂孔（因氧气进入）、忌不洁孔（多因上胶位置玻璃未洗净）、忌不齐孔（因上样孔底部有气泡、碎胶、未冲孔、不均匀缩胶、不正确拔梳）等特点PVDF膜NC膜尼龙膜灵敏度和分辨率高高高背景低低较高蛋白结合能力100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合）80-100ug/cm2400ug/cm2机械强度强干的膜易脆软而结实溶剂抗性强差差使用前是否需要浸润100%甲醇润湿!!!缓冲液润湿缓冲液润湿适用染色方法胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁不能用阴离子染料适用检测方法显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测显色法、化学发光、荧光、放射性显色、化学发光、放射性适用范围普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析普通蛋白WB、氨基酸分析。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用价格高较低低膜的选择问题PVDF膜的选择问题转膜缓冲液问题最好现用现配!夹心结构问题夹心结构:正—滤、膜、胶、滤—负大小：滤纸=膜=胶注意事项:①膜用甲醇预处理②膜随时保持湿润（传统）③尽量使用新滤纸④各层叠放次序正确⑤不能有气泡平衡问题：①膜与胶泡于转膜缓冲液中②5~120min(蛋白分子愈小,时间愈短)纤维垫转膜效果问题(A)透视法,(B)考马斯亮蓝染色(C)丽春红（可逆）(D)酰胺黑(E)CPTS总蛋白染色.丽春红S染色法：带负电丽春红S与带正电的氨基酸残基及蛋白的非极性区结合,从而形成红色条带.透视法：①干燥PVDF膜后，20%甲醇浸湿；②蛋白区透明③方便、可逆、蛋白不损、无需染料转膜方式：A.电泳转移(半干转、湿转)B.虹吸转移转膜电压：10~25V（半干转）转膜电流：1~2mA/cm2，10%gel转膜问题虹吸转移膜滤纸胶-+膜滤纸胶滤纸转膜问题转膜时间A.根据蛋白分子量、胶浓度、具体情况决定。B.检测多个蛋白时，需进行切胶，分别转膜。使用0.2μm的PVDF转印膜（PSQ，呈淡蓝色）转移缓冲液中适当增加甲醇（防止平衡时小分子流失）转移缓冲液中适当减少SDS（防止SDS抑制膜与蛋白的结合）降低凝胶的平衡时间（≤10min）降低电泳转膜时间（＜25min）tricine-SDS-PAGE小分子蛋白的“流穿”问题封闭问题定义:使用含有惰性蛋白质或非离子去污剂的缓冲液（PBST/TBST）封闭杂交膜上的非特异性位点举例:①non-fatmilk(脱脂奶粉②BSA（胎牛血清）③casein（酪蛋白）④Tween-20（吐温-20）⑤gelatin(明胶)⑥商业化的封闭试剂封闭牛E牛兔固相载体人源目的蛋白兔源二抗(抗牛Fc段)牛源一抗HRP兔E兔源二抗胎牛血清封闭问题注意事项:抗磷酸化抗体不能用酪蛋白或含磷酸酶的封闭液.生物素、刀豆蛋白交联二抗不用脱脂牛奶同种封闭液的批间差异完全溶解、过滤去除难溶颗粒牛、羊、马源的一抗尽量不用BSA或脱脂奶粉一抗：根据目的蛋白的性质、种属选择合适一抗。注意一抗的种属，单/多克隆及适用方法等。根据说明书推荐或预实验优化最佳稀释比例。加叠氮钠，４℃分装保存，忌反复冻融。二抗：根据一抗的来源种属以及Ig亚型（G、A、M等）选择合适二抗。选择合适的标记物（HRP、AP、GOD、生物素、荧光素、胶体金）加或不加硫柳汞，４℃分装保存，忌反复冻融。根据说明书推荐或预实验（Dotblotting）优化最佳稀释比例。抗体问题Dotblot设置合适的对照组阳性对照：明确表达目的蛋白，用于检测抗体的工作效率阴性对照：明确不表达目的蛋白，用于检测抗体的特异性二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性及stripping效果内参对照：检测实验体系是否正常工作、进行半定量分析空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的封闭及stripping效果对照问题内参问题内参名称分子量大小适用范围beta-actin43kDa胞浆和全细胞GAPDH30-40kDa胞浆和全细胞Tubulin55kDa胞浆和全细胞VCDA1/Porin31kDa线粒体COXIV16kDa线粒体LaminB166kDa细胞核TBP38kDa细胞核根据内参蛋白与目的蛋白的分子大小选择根据内参蛋白的存在部位确定内参不受实验处理因素影响适用于检测两种分子量接近的蛋白适用于检测目的蛋白的特定修饰状态50℃,150~200rpm,30min(需加β-巯基乙醇)商品化温和的洗脱液(37℃,60rpm,10~30min)若不换抗体,可不Stripping而直接封闭加抗体检测；通过二抗对照及空白对照检测Stripping效果；Stripping问题无信号(白板)或弱信号(不是白板胜似白板)高背景(黑板、几尽黑板)非特异性条带（杂带）脏带（操作）、补丁染色表情条带（微笑、皱眉）闹鬼（鬼带、鬼影）拖尾、纹理、偏斜、过长、过粗条带其它WB常见问题1.样品样品中无目的蛋白或目的蛋白降解----①设立阳性对照②检查封闭液是否有蛋白酶③使用蛋白酶抑制剂上样量不够或蛋白表达丰度较低-----①增加上样量②浓缩纯化样品2.转膜转膜不完全---①转膜后使用丽春红染色②使用蛋白质Marker.洗涤过度------减少洗涤时间和次数.3.封闭封闭过度-----①减少封闭液浓度及封闭时间②更换封闭试剂4.抗体孵育和检测头抗体浓度和孵育时间不够-----①增加抗体浓度②延长孵育时间一抗不工作----------设置阳性对照二抗不工作----------和其他一抗配合检测二抗是否工作一抗/二抗不匹配---检查抗体的来源和亚型。正确选择二抗底物失活或灵敏度低---①重新配制有效的底物②更换高灵敏度底物无信号/弱信