自由基及检测方法

ESR电子顺磁共振（EPR）或称电子自旋共振（ESR）现象最早发现于1944年。它利用具有未成对电子的物质在磁场作用下吸收电磁波的能量使电子发生能级间的跃迁的特征，对顺磁性物质进行检测与分析。自旋捕集方法是将不饱和的抗磁性化合物（自旋捕集剂）加入反应体系,与反应体系中产生的各种活性高、寿命短的自由基结合形成相对稳定的自旋加合物,以适于ESR检测其原理是利用适当的自旋捕捉剂与活泼的短寿命自由基结合,生成相对稳定的自旋加合物,可以用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量,利用自旋加合物的数量来计算原来自由基的多少。H：V：ESR测自由基是怎么被检测的（细胞，组织，溶液？体内，体外？）(MGD)2-Fe2+,是含有10mmol·L-1MGD和2mmol·L-1FeSO4的溶液。体外捕集：处死后取组织（血液、细胞），加入捕集剂，ESR测定体内捕集：腹腔注射捕集剂，处死取组织（血液、细胞），ESR测定腹腔注射几乎没有检测到自由基信号，或者信号很弱，而处死后样品加捕获剂则可以检测到自由基信号。通用捕获剂典型的自旋捕捉剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，把足够量的自旋捕捉剂加入到产生自由基的体系中，自旋捕获剂就会快速地和任何出现的自由基反应，最后给出稳定的可检测的氮样氧自由基加合物。所形成的自由基加合物的ESR谱上有被捕自由基基因给出的超精细分裂,可鉴别被捕自由基通用自旋捕获剂所形成的自由基加合物对自由基结构变化相当敏感，ESR技术检测O-2O-2可以与1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)(钛铁试剂)快速反应生成一种称之为“Tiron半醌自由基”的自旋加合物，比较稳定，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(EPR)进行检测，从而解决了生理条件下水溶液中寿命极其短暂的O-2·的定性和定量问题ESR技术检测·OHDMPO作自由基捕获剂对自由基结构变化相当敏感,可以提供自由基结构的详细信息。它与·OH产生的自旋加合物的ESR谱表现出特别容易识别的特征谱线。在溶液中容易形成的自我捕集产物二聚体自由基不会干扰实验结果。ESR技术检测血红蛋白结合的一氧化氮在组织或血液中，一氧化氮大多与氧或过渡金属反应生成了硝酸盐或亚硝酸盐以及一氧化氮与金属的配合物。一氧化氮与血红蛋白的结合速率常数非常高，而且能够得到有特征的ESR波谱。利用这一性质，我们可以用血红蛋白作为一氧化氮的捕集剂检测一氧化氮自由基。但是，HbNO极易氧化，这就限制了这种方法在富氧条件下的应用。ESR技术检测生物体系产生的一氧化氮一氧化氮与含金属蛋白反应产生的亚硝酰的金属配合物，往往会抑制细胞中许多重要的酶，对细胞产生毒害作用。目前应用较多的捕集剂的有Fe2+-(DETC)2，它可与一氧化氮形成稳定的单亚硝酰-铁配合物MNIC，给出特征的ESR波谱。但由于Fe2+-(DETC)2不溶于水，在一定程度上限制了它的使用。铁配合物捕集一氧化氮的最新进展得益于Komarov等人的研究，他们使用DETC的衍生物MGD，与亚铁离子合成稳定的亲水性配合(MGD)2-Fe2+，该配合物易溶于水(MGD)2-Fe2+非常适合捕集检测活细胞或组织中放的一氧化氮。但MNIC-DETC为疏水性物质，MNIC-MGD为亲水性物质;MNIC-DETC可附着于细胞膜甚至进入细胞，而MNIC-MGD不能进入细胞。因此，根据其各自的特性，实验中应选取不同的捕捉剂。分光光度法概念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分的特点。原理：利用自由基使显色剂发生颜色变化,根据吸光度的变化值而间接测得自由基的含量1、羟基自由基1．1水杨酸法Fenton反应产生·OH,·OH氧化水杨酸得到2,3-二羟基苯甲酸,用其在510nm处的吸光度值表示·OH的多少,吸光度值与·OH的量成正比。1．2细胞色素C氧化法其反应机理为·OH能使还原型细胞色素C(浅红色)氧化成氧化型细胞色素C(浅黄色)通过测定反应体系中吸光度的减少量(550nm),间接测得·OH的含量。1．3脱氧核糖法采用Fe3+-EDTA-抗坏血酸-过氧化氢体系产生·OH。此方法中脱氧核糖作为·OH的攻击目标。脱氧核糖受·OH攻击后裂解,在酸性、加热的条件下可与硫代巴比妥酸反应生成红色化合物。可根据在532nm处测定的吸光度值来间接反映·OH的含量。1．4DMSO羟自由基氧化DMSO生成的甲醛与2,4-二硝基苯肼（DNPH）反应在碱性条件下生成稳定的酒红色腙类物质，其最大吸收波长为390nm，分光光度法测定其含量可间接测定羟自由基的生成量。1.5氧化褪色分光光度法亚甲兰(MB)、二甲基亚砜（DMSO）、溴邻苯三酚红(BPR)、茜素紫、邻二氮菲-Fe2+Fenton反应产生·OH,·OH使邻二氮菲-Fe2+氧化为邻二氮菲-Fe3+,使邻二氮菲-Fe2+在536nm处的最大吸收峰消失。根据536nm处吸光度变化判断受试物清除·OH的能力。需要注意的是,测定时加样方法对结果有重要影响,需先将邻二氮菲、PBS及水混匀,并且每管加入FeSO4后立即混匀,否则会使局部颜色过浓,影响结果的重复性。2、超氧自由基超氧自由基的分光光度法测定,最常用的方法有细胞色素C的超氧自由基还原法和硝基四氮唑蓝(nitrobluetetrazolium,NBT)还原法。具有氧化活性的细胞色素C被O2-还原后,形成了在波长550nm处有强吸收的亚铁细胞色素,可以用于O2-的测定。但是,细胞色素C还原法的体系中如果存在着其他还原性物质便会对结果造成干扰,如还原性酶的干扰。NBT在O2-的作用下,还原生成不溶于水、蓝色的二甲臜(Diformazan),它的最大吸收波长560nm,吸光系数达10000以上,测定灵敏度相当高。肾上腺素氧化法以肾上腺素氧化为肾上腺素红作为O2-生成的指标。测定310nm处肾上腺素红的产量可间接测出反应体系的O2-含量。该法操作简便,而且灵敏度可以设法增加,但干扰因素较多。在羟胺氧化法中O2-可氧化羟胺生成亚硝酸根,在酸性条件下,亚硝酸与氨基苯磺酸和N2甲奈基二氨基乙烯反应生成红色化合物,后者在530nm处有最大吸收峰,测定在530nm处的吸光度变化,可以间接的反映O2-的含量,但是该方法存在一定的缺点,如甲萘胺溶液不稳定、空白值较大等。3、NOGriess试剂由磺酸(sulpheilicacid)和萘乙二胺组成。在酸性条件，这一试剂可以与亚硝酸盐反应生成红色物质在545－-555nm有一个最大吸收。可以用分光光度计检测。Griess试剂法最大的优点是简便易行，通常只需要将试剂加入待测的样品中即可。但是这种简单做法在生物体系中却常常不能准确反映一氧化氮的生成量。因为一氧化氮会发生反应，并依环境及时间按一定比例生成亚硝酸盐或硝酸盐。另外，某些生物体系如血液，尿液及体液中本身就存在一定浓度的硝酸盐和亚硝酸盐，这就需要使传统的Griess法与新的技术相结合，增加灵敏度并同时检测硝酸盐及亚硝酸盐的含量4、CATCAT作用于底物中过氧化氢,使过氧化氢分解成水和氧气,体系中残留的过氧化氢再与钼酸胺作用生成黄色复合物,其呈色的深浅可用分光光度计进行测定,从而反应出过氧化氢酶活性,是一个简易快速及精确的检验方法。5.SOD5.1细胞色素C还原法细胞色素C还原法(McCord法)：原理是黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中产生的O2-使一定量的氧化型细胞色素C还原为还原型细胞色素C，后者在550nm有最大光吸收。在SOD存在时，由于一部分O2-被SOD催化而歧化O2-还原细胞色素C的反应速度则相应减少，即其反应受到抑制。将抑制反应的百分数与SOD浓度作图可得到抑制曲线，由此计算样品中SOD活性。本法是间接法中的经典方法，但本法灵敏度较低。5.2NBT法O2-可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一个酶活力单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所用的酶量。5.3邻苯三酚自氧化法利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为绿色，最后转变为黄色。黄绿色产物在325nm处测定溶液的吸光度。加入酶液使O2-歧化，产生O2和H2O2,是中间产物不能累积。酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加。6、GSH-Px谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。硒是GSH-Px酶系的组成成分，它能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。总体上来说,分光光度法操作简单,费用少,仪器设备价格低廉,但存在检测的灵敏度较低,检测限较高,专一性不强等缺点。分光光度如何定量根据朗博（Lambert）-比尔（Beer）定律：A=abc式中A为吸光度，b为溶液层厚度（cm），c为溶液的浓度（g/dm3），a为吸光系数。其中吸光系数与溶液的本性、温度以及波长等因素有关。化学发光法（CL）化学发光的原理是发光剂被自由基氧化成激发态，反应物或产物分子从中获得能量的电子激发，形成电子激发态,当返回基态时,以发射光子的形式释放能量,这一过程称为化学发光(CL)。常用的发光试剂鲁米诺（氨基苯二酰一肼）和光泽精（N，N二甲基二吖啶硝酸盐）鲁米诺可检测活性氧（氧、H2O2、O-2、·OH）、LPO、NO在碱性溶液中(pH10左右),首先形成单价阴离子,然后在催化剂,如酶,Fe2+,Co2+,Ni2+和Cu2+等过渡金属离子或者金属络合物的催化下与溶液中的溶解氧或者过氧化氢发生氧化还原反应,生成激发态的两价阴离子氨基肽酸盐(APD),APD经非辐射性跃迁回到基态时,放出光子。检测光的强度就可以确定自由基含量。光泽精对O-2有特异性在碱性条件下,光泽精与O-2等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶(N2methylacridan)。利用光泽精化学发光法也可检测细胞线粒体内特定种类的自由基:光泽精通过其本身的正电荷与线粒体内膜上负电荷之间的作用通过线粒体膜线粒体内膜后首先被还原成单价光泽精自由基,然后光泽精自由基与O-2反应生成不稳定的中间物并分解出激发态分子,激发态分子跃迁到基态的过程中释放光子,通过微弱发光仪测定发光强度,以此间接测定O-2的生成及数量。但是在实际应用中,H2O2的分解过程同样会产生O2-·自由基,可能会影响结果的准确性。臭氧测NO臭氧与一氧化氮反应速度极快，发光强大。基于一氧化氮和臭氧反应原理的化学发光检测灵敏度高，但是只能检测气相体系的一氧化氮，目前很多实验作了种种改进，也可检测液相中的一氧化氮，甚至将硝酸盐及亚硝酸盐还原为一氧化氮来检测。NO+O3→NO2·NO2·→NO2+h化学发光法是一种灵敏、准确检测自由基的方法。与ESR和HPLC法相比，具有操作简便、设备成本较低、测定快速等优点。化学发光法缺点（评价）缺点：但是在进行复杂样品分析的时候，由于发光体系的选择性很差，不能对待测组分很好的定性，是其在实际应用中受到了很大限制。优点：化学发光法是一种简便、快速、灵敏的痕量分析方法。对于成分简单的样品，