细胞生物学常用技术原理与应用

细胞生物学常用技术原理与应用安云鹤2016.7.2一、细胞计数方法二、细胞活力测定三、细胞冻存复苏四、克隆形成实验五、侵袭转移实验六、划痕愈合实验七、细胞凋亡检测八、细胞周期测定九、免疫细胞化学十、细胞转染实验一、细胞计数方法悬浮及半悬浮细胞半悬浮生长细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用吸管直接吹打使细胞从瓶壁脱落下来。贴壁细胞计数设备血细胞计数板血细胞计数仪计数方法将血球计数板及盖片擦拭干净，将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静臵3min。镜下观察计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。计数方法按如下公式计算镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算；若细胞团占10%以上，需重新制备细胞悬液。二、细胞活力测定总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。细胞活力的测定是细胞体外研究中应用最广的技术手段之一。组织中分离细胞及细胞复苏常需要检查活力。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，很难从形态上区别死、活细胞。常用噻唑蓝比色（MTT）法、台盼蓝法。MTT法活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将MTT还原成不溶于水的蓝紫色结晶产物formazan（甲瓒），并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解沉积的甲瓒，溶液颜色深浅与其含量成正比，可用酶标仪测定OD值。MTT法广泛应用于新药筛选、细胞毒性、肿瘤放射敏感性实验等。台盼蓝法将细胞悬液与等量的0.4%台盼蓝染液混合，染色2-3min。镜下可见死细胞被台盼蓝染成深蓝色，活细胞不被染色呈无色透明状。细胞活力测定须与细胞计数合并进行，但要考虑染液对细胞悬液的倍比稀释。三、细胞冻存复苏细胞低温冷冻贮存是细胞培养的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以节省人力、经费，减少污染和细胞生物学特性变化。冻存复苏的原则：慢冻快融技术原理当细胞冷至0℃以下时，细胞器开始脱水，细胞中可溶性物质浓度升高并析出，在胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，胞内不致产生大的冰晶，否则会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是避免胞内重新形成冰晶。技术原理在细胞冻存时应加入低温保护剂。常用的低温保护剂是二甲基亚砜（DMSO）。DMSO是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，降低冰点，延缓冻结过程；并提高胞膜对水的通透性，使胞内水分在冻结前析出胞外，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。冻存方法预先配制冻存液：70%培养基+20%血清+10%DMSO。胰酶消化对数生长期细胞，经离心弃上清后加入适量冻存液吹打成细胞悬液（1-5×106个/ml）。细胞悬液按规格加入至冻存管中，密封后标记细胞名称、研究者姓名和日期。4年内存活率最高可达80%以上。冻存方法标准程序冻存管臵于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，次日转移至液氮中长期保存。冻存管臵于程序降温仪中，先设定按1-2℃/min降温，达到-25℃以下时再按5-10℃/min降温，达到-100℃时可迅速转移至液氮中。冻存方法简易程序冻存管首先臵于4℃，约40min。之后臵于-20℃，约30-60min。再臵于-80℃中放臵过夜。最后臵于液氮罐中长期保存。冻存方法快冻程序冻存管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳。通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按1-2℃/min速度降温，在30-40min内降至液氮表面，停30min后直接投入液氮中。复苏方法从液氮中取出冻存管，迅速投入37℃水浴并不断摇晃，使管中的液体快速融化。在5min内将细胞悬液转移至培养瓶内，补充适量的预热的新鲜培养液。四、克隆形成实验平板克隆形成适用于检测单个贴壁生长细胞形成克隆的能力，从而反应细胞增殖状况。对于肿瘤细胞来说，克隆形成能力越高则反应其恶性程度越高。两个指标反应细胞增殖能力：①克隆形成率；②克隆大小。平板克隆形成每平皿（D=60mm）接种100-200个细胞，补加培养液至10ml，≥3平皿/组。十字形晃动使细胞分散均匀，常规培养2-3周（当出现肉眼可见的克隆时终止培养），弃培养液，PBS洗涤2次。甲醇固定15min，姬姆萨染色20min，自来水冲洗，空气干燥。计数肉眼可见的克隆数。克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。平板克隆形成平板克隆形成必须选择对数生长期细胞。计数要准确，至少三遍，取平均值。在接种细胞时，细胞数避免过多，否则会出现细胞克隆融合并给计数带来麻烦，同时一定要使细胞分散均匀。一般情况下，接种200个细胞时，10ml培养液足够支撑3周，中间不必换液，主要注意防止污染。软琼脂克隆形成原适用于非贴壁生长细胞，但某些恶性肿瘤细胞不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下也能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力同样反映其恶性程度。某些细胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，则不适用该方法。软琼脂克隆形成底层琼脂的制备：将1.2%低熔点琼脂糖与2×培养基等体积混合，室温下待完全凝固。上层琼脂的制备：将0.7%低熔点琼脂糖与2×培养基等体积混合，加入细胞悬液，充分混匀，≥3孔/组。常规培养2-3周，加入0.1%结晶紫染液，室温染色1h，镜下计数。每个细胞集落≥50个细胞为1个克隆。软琼脂克隆形成软琼脂克隆形成技术要点同平板克隆形成实验，但操作步骤相对复杂。注意上层琼脂温度，太高容易引起部分细胞死亡，太低则容易使局部结块。接种的细胞数要根据细胞增殖能力或者恶性程度来决定。当细胞增殖能力非常强时，可适当减少，反之可增加。五、侵袭转移实验基本概念Transwell本指一类有通透性的杯状装臵，实质是一种膜滤器或通透性支架。目前作为一种实验技术，其主要材料是Transwell小室（TranswellchamberorTranswellinsert），外形为一个可放臵于孔板上的杯状装臵。不同厂家有不同型号，也有不同形状和大小。根据实验需要，可有不同选择。基本概念无论何种外形，关键部分均为杯子底层的一张有通透性的膜，其余部分的材料与普通孔板是一样的。膜孔径大小规格0.1-12.0μm，一般常用材料是聚碳酸酯膜（polycarbonatemembrane）。Transwell小室内称“上室”，培养孔内称“下室”，上室、下室内分别盛装上层、下层培养液，两者以膜相隔。技术原理细胞接种在上室，由于膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对上室细胞生物学行为的影响。技术原理共培养体系膜孔径≤3.0μm，细胞不能迁移通过。若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过膜，则应选择3.0μm以下孔径。例如：A细胞接种于上室，B细胞接种于下室，研究B细胞分泌或代谢产物对A细胞的影响。趋化性试验常选用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过膜进入下室，计数进入下室的细胞数可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。例如：研究B细胞对A细胞的趋化作用，操作步骤同共培养体系。细胞迁移试验常选用8.0、12.0μm膜，上室接种细胞，下室加入某种趋化因子（如生长因子），细胞向高营养的下室迁移。计数进入下室的细胞数可反映细胞的迁移能力。细胞分组处理后，弃培养液，无血清饥饿培养12h，经0.25%胰酶消化后，调整细胞浓度。上室加入细胞悬液，下室加入含趋化因子的培养液，常规培养24h，≥3孔/组。细胞迁移试验取出小室，预冷甲醛固定20min，避光染色30min，用棉签轻轻擦拭膜上室面的细胞。小心切下膜片，臵载玻片上滴加中性速干胶后以盖玻片封片。镜下计数，每张膜随机取5-10个视野。细胞迁移试验上层培养液采用无血清培养基，需加入0.05%-0.2%BSA维持渗透压。加样及取放培养板时，动作轻柔，避免下室培养液和小室之间产生气泡，否则下室的趋化作用会减弱甚至消失。膜下产生少量小气泡属于正常现象。开始培养1-2h后，取出培养板观察，确保膜下无大气泡。细胞迁移试验细胞侵袭试验技术原理及要点同细胞迁移试验，唯一不同之处是在膜上室侧铺上一层基质胶（matrigel），以模仿体内细胞外基质。细胞先分泌基质金属蛋白酶（MMPs），将基质胶降解后，方可穿过膜。计数进入下室的细胞数可反映细胞的侵袭能力。基质胶保存于-20℃，呈固态；4℃时融化为液态；37℃时快速凝固成胶状。细胞侵袭试验使用前将基质胶臵于4℃过夜融化为液态备用。用无血清培养基稀释基质胶，根据需要确定最佳包被浓度。目前采用Matrigel（BD公司）1：20稀释液包被基底膜，包被量至少应覆盖膜表面（50μl/孔，24孔板），37℃过夜成胶。细胞侵袭试验为保证基底膜的成胶性能与稳定性，Matrigel稀释浓度不应低于1：3，成胶后须立即使用。包被基底膜须冰上操作，并用预冷的无血清培养基稀释Matrigel，否则在室温下，Matrigel尚未完成包被就已成胶。细胞侵袭试验细胞侵袭试验细胞迁移侵袭选择的时间点须尽量控制（12-48h）。除了考虑细胞侵袭力外，不能忽视处理因素对细胞数目的影响。不宜过长：时间点必须限定在处理因素不影响实验组细胞数目内。不宜过短：细胞内储存一定量的MMPs，短时间内细胞的侵袭能力可能不会有太大改变，而且处理因素影响MMPs从表达到释放需要一个过程。六、划痕愈合实验技术原理简称划痕实验，适用于体外研究细胞迁移运动能力，操作简单、应用广泛。在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。臵于镜下拍照，记录划痕边缘的细胞逐渐进入空白区域，即“划痕”愈合过程。根据“划痕”愈合的速率反映细胞迁移的速率。技术原理细胞在6孔板或平皿内培养至90%融合状态时，用10μL枪头沿底部划线。加入培养基及不同处理因素，常规培养。在不同时间点分别拍照记录。计算细胞迁移率。迁移率=【（T0时划痕宽度值-Tt时划痕宽度值）/T0时划痕宽度值】×100%。结果分析七、细胞凋亡检测基本概念细胞凋亡（Apoptosis）又称为细胞程序性死亡，由不同的生理或者病理因素引起，是一个主动的、高度有序的、基因控制的、一系列酶参与的过程。细胞凋亡对个体的正常发育及在病理学研究中的重要作用，成为目前生命医学最为热门的研究领域之一。细胞凋亡主要表现在细胞形态学及生物化学变化。基本概念针对细胞凋亡不同阶段的研究方法形态学观察DNALadderELISA法TUNEL法Hoechst33258染色法流式细胞术TUNEL法细胞发生凋亡时，激活某些DNA内切酶切断核小体间的基因组DNA。此时抽提DNA进行电泳检测，可见180-200bp的DNALadder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH在TdT催化下连接上Biotin-dUTP，随后和Streptavidin-HRP结合，最后通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可在镜下检测到凋亡细胞。TUNEL法TUNEL法TUNEL法本法适用于石蜡切片、冷冻切片和人工培养的或从组织分离的细胞凋亡测定。由于DNA断裂方式不同，本法可特异性检测出细胞凋亡，因此可区分细胞凋亡和细胞坏死。严格判断细胞凋亡时，应同时检测多个指标。①极少数细胞凋亡时无DNA断裂，因而不适用本法；②个别类型的坏死细胞可出现TUNEL法检测阳性。Hoechst33258染色法Hoechst33258是一种可穿过细胞膜与活细胞结合的蓝色荧光染料，细胞毒性相对较低。染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。与双链DNA结合后，可干扰DNA复制和细胞分裂，具有致畸性和致癌性，使用和废弃时须谨慎。Hoechst33258染色法正常细胞核质染色均匀；凋亡细胞染色质发生固缩，故其在等渗条件下吸收染料的能力增强，细胞核呈致密浓染。流式细胞术AnnexinV-PI双染色法在细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到膜外并暴露在膜表面。AnnexinV是一种依赖Ca2+的磷脂结合蛋白，具有