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△△Ct法的推导过程PCR指数扩增公式是：Xn=X0*(1+Ex)n[1]式中，Xn是第n个循环后目标分子数，Xo是初始目标分子数，Ex是目标分子扩增效率，n是循环数。用Ct代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，因此：Xt=X0*(1+Ex)Ctx[2]式中，Xt是目标分子X达到设定的阈值时的分子数，是一个常数。虽然每台机子设定阈值的荧光信号是一样的，但是由于每份子不同双链DNA能结合的SYBR的量是不同的，所以不同目的基因的Xt是不同的，但是对某个特定的基因Xt是特定的的常数。Ctx是目标分子X扩增达到阈值时（即达到规定的拷贝数时）的循环数。对于看家基因的PCR反应，也有同样的公式：Rt=R0*(1+ER)CtR[3]式中，ER是看家基因R扩增效率。Rt是看家基因R达到设定的阈值时的分子数假设目标序列与看家基因扩增效率相同，EX=ER=E，用目标分子数（常数）除以看家基因分子数（常数），即目标分子与看家基因的表达量比值K，K是一个常数。K=Xt/Rt=[X0*(1+E)Ctx]/[R0*(1+E)CtR]=（X0/R0）*(1+E)Ctx-CtR[4]将Ctx-CtR称为△Ct，（X0/R0）称为XN（初始目标序列与看家基因的分子数比值，其意义是经过通过内参校正之后的初始目标分子数），整理上式得：XN=K*(1+E)-△Ct[5]最后用任一样本q的XN除以参照因子（calibrator，cb）（参照因子可以是正常对照也可以是相对对照）的XN得到：XN,q/XN,cb=[K*(1+E)-△Ctq]/[K*(1+E)-△Ct,cb]=(1+E)–(△Ctq-△Ct,cb)[6]于是将△Ctq-△Ct,cb称为△△Ct，这种数据分析方法称为△△Ct法。对于一个少于150bp的扩增片断而言，如果Mg2+浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率E接近于1。因此目标序列的数目通过内参校正之后相对于参照因子而言就是初始目标基因数/初始参比因子数XN,q/XN,cb=2-△△Ct整理式[5]得，XN/K=2-△Ct常数K=Xt/Rt，在K≠1时，即达到阈值时，目标基因数≠看家基因数，其意义是消除实验处理造成的目标基因数≠看家基因数的因素后，初始目标基因数/初始看家基因数；当K=1时，XN=2-△Ct。我之前一直认为算到△Ct就够了，因为知道目的基因相对内参表达的量XN，但是不要忘了我们还不知道K值.举个例子：假设扩增效率E=1，对照组内参基因（理论下每个细胞表达是一样的）CT值20，目的基因CT值18；实验组内参基因CT值20，目的基因CT值17，那么X对照组=K*(1+1)-△Ct=4K;X实验组=K*(1+E)-△Ct=8K，因为我们无法计算K值，所以不管是对照组还是实验组目的基因与内参基因的比值都无法得知，但是我们可以计算说实验组目的基因表达是对照组的8K/4K=2倍，得出处理过的实验组目的基因比没有处理过的对照组目的基因表达增加了1倍，其实我们也只是要这个目的。但是到底是要除以对照组还是随便哪一组的，之前群里一直有人讨论，但是根据我们推算，除以任何组都可以，（8K/XK）/（4K/XK）=2，但是如果是除以对照组的话，那么对照组就会变成1，实验组直接是1的倍数，这样作图就更方便，所以很多人会除以对照组。这就是为什么要算△△Ct。