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第四章沉淀法生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。第一节概述⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。基本概念通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技术称为固相析出技术。结晶法：在固相析出过程中，析出物为晶体时称为结晶法。沉淀法：在固相析出过程中，析出物为无定形固体时则称为沉淀法。常用的沉淀法主要有盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。◆沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。◆通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；沉淀法的特点和应用◆沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。◆沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。一般情况下，沉淀分离方法在生物下游加工过程中通常作为初级分离技术加以使用，但在实际过程中也有仅通过沉淀分离得到目标产品的工业实例。基本原理：根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。沉淀的分类在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。⑸有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法，主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyeneglycol）作为沉淀剂。蛋白质组成20种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性氨基酸和亲水性氨基酸蛋白质折叠趋势疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势结果在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区第二节蛋白质的表面特性蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。防止蛋白质凝聚沉淀的屏障⑴蛋白质周围的水化层（hydrationshell)可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。⑵蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）胶体的定义胶体是一种尺寸在1～100nm以至1000nm的分散体。它既非大块固体，又不是分子分散的液体，而是具有两相的微不均匀分散体系。-《被遗忘了尺寸的世界》WilhelmFriedrichOstwald(1853–1932)蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。★静电斥力★吸引力蛋白质/胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。吸引力颗粒间的相互作用颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。VanderWaals力Keeson引力（偶极力）Debye引力（诱导力）London引力（色散力）是最重要的一种引力，因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。DLVO理论颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现为吸引位能。沉淀策略及方法策略破坏蛋白质周围的水化层降低双电层厚度（ζ电位）沉淀方法改变溶液pH值加入无机盐或改变无机盐种类加入水溶性有机溶剂添加脱水剂定义：蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为“盐析”。第三节盐析法两种现象：盐溶：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大。盐析：高盐，盐离子强度增加，蛋白质溶解度减小。2.52.01.51.00.50-0.5-1.0-1.5123456βμlogSS0应用：蛋白质和酶分离提纯多肽、多糖和核酸也可以用盐析法进行沉淀分离20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清。一、盐析法的原理及特点原理形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了水化膜，使其沉淀。Cohn方程式现在常用Cohn经验式来表示蛋白质的溶解度与盐的浓度之间的关系：㏒S=β－ＫsＩ式中S——蛋白质的溶解度，g/L;I－一离子强度等于I=1/2∑mizi2;mi——离子i的摩尔浓度；Zi——所带电荷；β——常数，与盐的种类无关，但与温度、pH和蛋白质种类有关;Ks——盐析常数，与温度和PH无关，但与蛋白质和盐的种类有关。用盐析法分离蛋白质的二种方法⑴在一定的pH值及温度条件下，改变盐的浓度（即离子强度）达到沉淀的目的，称为“Ｋs”分级盐析法。（Ks盐析：固定pH,温度，改变盐浓度）⑵在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达到沉淀的目的，称为“β”分级盐析法。（β盐析：固定离子强度，改变pH及温度。）当离子强度较高时，溶解度的对数与离子强度呈线性关系①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作用，不易引起蛋白质变性优点缺点盐析法分辨率不高，适合于生化物质粗提纯阶段，需和其它方法交替使用。二、影响盐析的因素（一）离子强度和类型一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价阴离子更为明显。PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞I-NH4+＞K+＞Na+＞Li+盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵(二）溶质（蛋白质等）种类的影响血纤维蛋白原碳氧血红蛋白血清白蛋白拟球蛋白碳氧肌红蛋白μ0.500-0.50-1.000246810logS（三）蛋白质浓度的影响在相同的盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，但蛋白质的浓度愈高，其它蛋白质的共沉作用也愈强，从而使分辨率降低，-ddSP1098765432104050607080P30g/L3g/L一般常将蛋白质浓度控制在2～3％为宜。相当于25mg/mL～30mg/mL。（四）温度的影响：温度的变化会影响值。在无盐或稀盐溶液中，大多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，但在高盐溶液中常相反。210logS234μ25℃0℃pH6.6对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25℃）比0℃时溶解度低，更容易盐析。（五）PH的影响：蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。在等电点处溶解度小（值最小）。因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近34675７３４５６以磷酸盐沉淀COHb和以硫酸铵沉淀OA时，β随pH的变化８8OAβCOHbOA-卵清蛋白COHb-碳氧血红蛋白243o12lgSpH6.60℃25℃243o1温度和pH对碳氧血红蛋白的磷酸盐盐析曲线的影响2lgSpH7.437.1725℃6.056.806.60III三、盐析常用的盐常用的盐析用盐主要有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、磷酸钾等。（NH4）2SO4最常用：①溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到，（NH4）2SO4在0℃时仍有70.6％的溶解度，远远高于其它盐类：几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）0℃20℃80℃100℃(NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101②分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。③不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L的（NH4）2SO4保存可达数年之久。④价格便宜，废液不污染环境。但硫酸铵具腐蚀性且缓冲能力差，饱和溶液的pH值在4.5～5.5之间，使用时多用浓氨水调整到pH7左右。四、盐析操作（以硫酸铵为例）盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：（1）加硫酸铵的饱和溶液：在实验室和小规模生产中，或(NH4)2SO4浓度不需太高时，可采用这种方式，它可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。（2）直接加固体硫酸铵：工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；常用“饱和度”来表征硫酸铵在溶液中的最终浓度，25℃时(NH4)2SO4的饱和浓度为4.1mol／L，定义它为100%饱和度。盐析曲线的制作如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：①取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液，冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH值。②计算饱和度达到20%-100%所需加入的硫酸铵量，边搅拌边加入，放置1h以上，使沉淀达到平衡盐析操作-溶解度曲线确定③离心分离沉淀物并重新溶解测定其中总蛋白和目标蛋白的浓度④以饱和度为横坐标，上清液中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线第三节有机溶剂沉淀法定义：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。一、有机溶剂沉淀法的原理和特点原理1）加入有机溶剂后，会使水溶液的介电常数降低，导致蛋白质分子之间的静电引力增加，从而使蛋白质发生聚集沉淀。2）由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。蛋白质在有机溶剂中的沉淀特点分辨率高于盐析；乙醇等有机溶剂沸点低，易挥发除去，不会残留于成品中，产品更纯净；沉淀物与母液间的密度差较大，分离容易。但有机溶剂沉淀法易使蛋白质等生物大分子变性，操作需在低温下进行；需要耗用大量有机溶剂，成本较高;有机溶剂一般易燃易爆，所以贮存比较困难或麻烦。二、有机溶剂的选择和浓度的计算用于生化制备的有机溶剂的选择首先是