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§1-1DNA重组技术的基本工具和基本操作程序专题1基因工程一基因工程的基本内容•主要内容（一）基因工程的概念（二）基因工程的基本工具（三）基因工程的基本操作程序（四）基因工程的应用•基因工程的概念基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。复习•基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与运载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)复习•基因工程的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA连接关键步骤三：抗虫基因导入受体(棉花)细胞复习•解决基因工程关键步骤需要的工具关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：限制性内切酶DNA连接酶运载体复习•基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。特点：特异性。即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。复习识别序列•大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。•也有少数限制酶识别序列由4、5、或8个核苷酸组成。迄今为止，有300多种微生物中分离出4000种限制酶大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。限制酶限制酶被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。平末端•要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？提问要切两个切口，产生四个黏性末端。•如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。2、基因的针线——DNA连接酶DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。E.coliDNA连接酶•从大肠杆菌中分离得到的。只能用于粘性末端的连接T4DNA连接酶•从T4噬菌体中分离得到的。既能用于粘性末端的连接，又能用于平末端的连接，但是平末端的连接效率低。为什么要用运载体？1、直接将目的基因连接到受体细胞的DNA上不能表达。2、只有利用某种能够侵染受体细胞，并且在受体细胞中能够复制和表达的载体来用于表达。作为运载体必须具备哪些条件1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。常用的运载体主要有两类：1）细菌细胞质的质粒2）噬菌体或某些动植物病毒•质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的DNA分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的DNA分子。质粒是基因工程最常用的运载体。绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。•大肠杆菌的质粒：最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞的基因结构②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码•四个基本步骤：三、基因工程的基本操作程序1）提取目的基因2）目的基因与运载体结合3）将目的基因导入受体细胞4）目的基因的检测和表达•目的基因目的基因是人们所需要转移或改造的基因。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶1、目的基因的获取1〉目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子2〉获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成概念：基因文库（genelibrary）基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(genelibrary)基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.基因组文库与部分基因文库的关系cDNA文库的构建mRNA反转录cDNA(互补DNA）DNA聚合酶双链DNA②反转录法：基因重组反转录酶mRNAcDNA基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性。④利用PCR技术扩增目的基因PCR——聚合酶链式反应是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。DNA序列自动测序仪：PCR技术：对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。⑤人工合成——根据已知的氨基酸序列合成DNA蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成3、基因表达载体（重组质粒）的构建（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。（2）用___________切断目的基因，使其产生_________________。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同1〉过程:2〉基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞条件•步骤二：目的基因与运载体重组1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。质粒目的基因限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶表达载体同一种过程:2、基因表达载体的作用a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？•目的基因与运载体结合•常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。•将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。•步骤三：目的基因导入受体细胞1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌（2）基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。2、将目的基因导入动物细胞方法:显微注射技术操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA•步骤四：目的基因的检测和表达四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因(四)目的基因的检测与鉴定检测①导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法——DNA分子杂交②表达检测转录检测——分子杂交翻译检测——抗原抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。•受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。知识延伸——DNA分子杂交技术该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。返回DNA附着在膜上硝化纤维素加探针报告基因（含荧光素分子）变性DNA杂交（如检测SARS病毒等）abcd复习题1）将目的基因导入受体细胞有哪些方法?(试举例说明)2）简述农杆菌转化法非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子基因的结构启动子原核真核1）以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来C练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD练习3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A练习4）有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D练习5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因的检测和表达C练习