酶的固定化和固定化酶反应动力学

第四章酶的固定化与固定化酶反应动力学内容•酶的固定化•辅酶的固定化•细胞的固定化•固定化酶促反应动力学•固定化酶的应用第一节酶的固定化•酶在使用中的不足1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸、碱、有机溶剂对其有影响），2.不能回收，无法自动化、连续化生产，3.产物分离纯化增加困难。一、什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术化学偶联酶固定化间歇可溶交联包埋吸附间歇连续酶的固定化技术和固定化酶固定化酶的源流固定化酶是1971年在美国举行的第一次世界酶会议上推荐确定的。又称水不溶性酶、固相酶。50年代开始。将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，再与羧肽酸、淀粉酶等结合制成最早的固定化酶1969年。用固定化氨基酰化酶拆分DL-氨基。第一个工业生产的固定化酶。固定化酶的特点：•优点：1.不溶于水，易于与产物分离；2.可反复使用；3.可连续化生产；4.稳定性好。•缺点：固定化过程中往往会引起酶的失活，增加酶的成本固定化酶的作用模型（1）作用模型可以连续进行催化反应（适宜的底物浓度、温度、pH值）以羧甲基纤维素固定葡萄糖淀粉酶水解淀粉生产葡萄糖为例说明。（2）反应机理载体的作用：▼保持酶的立体结构▼保护酶的活性中心▼保证酶的连续催化反应制备原则（1）保护酶蛋白的立体结构不变。（2）避免不溶性载体与酶的活性中心发生作用（3）在温和条件下进行，避免高温、高压、强酸碱等化学方法、物理方法、物理与化学结合法三种。二、酶的固定化方法1.载体结合法•将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。•根据结合的方式不同，又可分为物理吸附、离子结合和共价结合三种。物理吸附•作用力：氢键、范德华力、疏水键等•吸附剂无机吸附剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等）有机吸附剂（纤维素、胶原等）比较受重视。特点•优点：酶活性中心不易被破坏，酶的高级结构变化少，操作简便。•缺点：酶与载体的结合力弱，酶易脱落。•吸附技术：a.混合浴或振荡浴吸附法b.反应器中直接吸附法c.电沉积法物理吸附法固定化酶举例载体固定化酶活性炭α－淀粉酶、β－淀粉酶蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶多孔玻璃核糖核酸酶、木瓜蛋白酶脂肪酶、葡萄糖氧化酶氧化铝葡萄糖氧化酶碳酸钙凝胶亮氨酸氨肽酶纤维素胰蛋白酶、核糖核酸酶麸素Β－淀粉液化酶硅胶磷酸化酶离子结合•通过离子键结合于具有离子交换基团的水不溶性载体的固定化方法。•吸附剂离子交换纤维素，离子交换葡聚糖，离子交换树脂等。特点•比物理吸附的结合力要强，操作方便，条件温和，可再生后反复使用。•缺点吸附力弱，不适宜的pH,高盐浓度，高底物浓度，高温等都能把吸附的酶解吸下来。•1969年最早用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用DEAE-葡聚糖凝胶固定的。共价结合•通过共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水的载体上。（1）酶与载体反应的主要功能基团游离羧基：肽链C－末端的α–羧基，天冬氨酸，谷氨酸的β－γ羧基游离氨基：肽链N－末端的δ－氨基，赖氨酸ε－氨基巯基：半胱氨酸羟基：丝氨酸，苏氨酸酚基：酪氨酸咪唑基：组氨酸（2）所用载体重氮化法：具有氨基的不溶性载体（R－NH2）。以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃烷化法：卤族的乙酰衍生物（氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维素、碘乙酰纤维素）含卤族的高聚物（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）（3）方法载体的活化：通过一定的方法，在载体上引进一个活泼基团a.重氮法a.将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。b.溴化氰法•含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件下，与CNBr反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件下，可与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。•此方法固定化后相对酶活力比较高，且相当稳定，同时操作也简便。是最受欢迎的一种方法.c.叠氮法•在酶分子与载体间形成肽键的固定化方法。主要是含羧基载体，转变成酰基叠氮氯化物，异氰酸盐等活化形态的衍生物，然后与酶的游离氨基反应，从而形成肽键。纤维素+盐酸甲醇CMC－甲酯＋肼CMC－酰肼CMC－叠氮化物＋NH2酶亚硫酸钠盐酸＋固定化酶－CH2CO-NH酶CMC－CH2COOH制备酰肼叠氮化物羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序d.烷化法•一般常用三氯三嗪基试剂活化纤维素，然后偶联酶,与酶的氨基、酚羟基、巯基反应，产生固定化酶（交联葡聚糖，琼脂糖，多孔玻璃等）。优缺点优点：酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长时间使用。缺点：制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏2共价交联法双功能试剂与酶蛋白质中的氨基酸残基作用，使酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶.常用的是戊二醛OOH—C—CH2—CH2—CH2—C—H发生作用的氨基酸残基：酪氨酸的酚基胱氨酸的SH巯基N－末端的a－氨基。常用的双功能或多功能试剂：戊二醛聚甲叉双碘乙酰胺双重氮联苯胺特点•反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较低。尽可能地降低交联剂的浓度和缩短反应时间有利于固定化酶比活性的提高。•缺点：固定化后，往往颗粒小，机械性能差。克服的方法•酶先吸附在载体上，或者包埋在胶内，微囊内，再交联或者固定成酶膜，或者酶网颗粒3包埋法制备固定化酶酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋在凝胶细小的格子中，或包围在半透膜或聚合物中。包埋方法有两种：•格子型固定化酶•微型胶囊法•格子型固定化酶（1）原理以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶存在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的网状格子中。反应为厌氧反应。酶液丙烯酰胺N，N－双丙烯酰胺引聚剂：过硫酸铵、核黄素光照聚合反应凝胶酶块固定化酶切割（2）方法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）凝胶或膜酶聚丙烯酰胺凝胶α、β－淀粉酶葡萄糖氧化酶乳酸脱氢酶淀粉胆碱酯酶琼脂青霉素酰胺酶（3）制备的固定化酶2微型胶囊法（1）原理把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球状含酶微型胶囊。（2）特点微囊直径几微米～几百微米。低分子底物可以自由通过并进入微囊内。与酶反应后的生成物被排除在微囊外，酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内缺点：单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防治酶的失活和变性。优点：A制备条件温和，制得的胶囊不易变化。B能很好地保存天然酶的活性和特性。C大小可任意调节，制备时间短。（3）微型胶囊法优缺点固定化酶的制法及其特性比较特性制备方法共价键结合法离子结合法物理吸附法包埋法制法难易易难酶活力高高高低底物特异性易变不变不变不变结合能力强中弱弱再生不可可能可能不可交联法难中易变强不可第二节辅酶的固定化1.辅基的固定化•对于必需辅基的酶，固定化酶时一般将辅基同时固定。•一般辅基分子和载体之间要接入0.5～1.0nm长的间隔基。•将辅基共价结合于载体上之前，要考虑在辅基分子的适当位置引入功能团，如引入羧基或氨基，使之易与载体偶联。•磷酸吡哆醛，FAD、FMN、TPP、生物素、硫辛酸、卟啉等可利用分子本身所具有的功能团。•将具有功能团的辅基先与间隔基结合，再与活化的载体偶联；或先使间隔基与活化载体结合，再与辅基偶联。2、辅酶的固定化•辅酶与酶蛋白的结合是松弛的，在固定时要保证能与两种酶都能有最恰当的结合。•将辅酶固定于一高分子上，然后用微囊法将辅酶和两种酶一同包埋于微囊内。•高分子化一般的顺序是先在辅酶的一定部位引入适当的功能基团或间隔基，生成辅酶的衍生物，然后再与水溶性高分子共价结合。第三节细胞固定化一、什么是固定化细胞？•通过各种方法将细胞与水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程•细胞固定化包括：1.微生物细胞固定化2.植物细胞固定化3.动物细胞固定化4.原生质体固定化固定化细胞特点1.优点:(1)省去了酶的分离手续．为多酶系统，无须辅因子再生。(2)细胞生长快、而且多、反应快。(3)可以连续发酵，节约了成本，排除产物抑制和消耗。(4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定。2.缺点：(1)保持菌体的完整，防止菌体自溶。(2)防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时需抑制胞内其他酶的活性防止副产物的形成。(3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。一包埋法1原理将细胞包进多孔载体内，小分子的底物和产物均可自由出入，而细胞却不会漏出。。2方法常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝胶、明胶、琼脂包埋法制备固定化菌体应用举例包埋材料菌种酶系用途琼脂大肠杆菌大肠杆菌谷氨酸脱羧酶青霉素酰胺酶制造γ-酪蛋白生产6-氨基青霉烷酸(6-APA)明胶－戊二醛短乳杆菌链霉菌葡萄糖异构酶从葡萄糖生产高果糖浆聚丙烯酰胺大肠杆菌天门冬氨酸酶醋酸纤维素大肠杆菌青霉素酰胺酶（裂解）青霉素酰胺酶（合成）生产6－APA生产半合成青霉素二载体结合法（吸附、离子结合法）1原理将细胞在适当的条件下与载体吸附或形成络合物固定在载体上。2常用载体硅藻土、多孔玻璃、离子交换纤维素、离子树脂、DEAE－纤维素。3优缺点优点：方法简单、载体易于再生。缺点：结合力弱，细胞易脱落。载体结合法制备固定化菌体举例载体菌体酶用途离子交换纤维素丝状菌孢子转化酶蔗糖的转化阴离子树脂放线菌葡萄糖异构酶制造果糖DEAE-纤维素巨大芽孢杆菌青霉素酰胺酶制造6APA第四节固定化酶催化反应动力学•固定化对酶活性及酶反应系统的影响•酶固定化后的性质变化•固定化酶反应动力学评价固定化酶的指标•相对活力＝固定化酶活力/相同蛋白量的游离酶活力＊100%•酶结合效率＝（加入的总酶活力－未结合的酶活力）/加入的总酶活力＊100%•酶活力回收率＝固定化酶总活力/加入的总酶活力＊100%•当固定化方法对酶活力没有明显影响时，酶结合效率与酶活力回收率近似。例子•氨基酰化酶20mL固定化，反应后滤液及洗涤液共50mL。若原酶活力1000u/mL，洗涤液活力20u/mL。0.5g固定化酶活力为100u（共得50g固定化酶）。问固定化酶的相对活力是多少？回收率及结合率是多少？一、固定化对酶活性及酶反应的影响1.构象改变、立体屏蔽•构象改变:固定化过程中酶和载体的相互作用引起了酶的活性中心或调节中心的构象发生了改变，从而导致酶活性下降的一种效应。多出现于吸附法和共价结合法。•立体屏障：载体的孔隙太小，或固定化的方式与位置不当，给酶的活性中心或调节中心造成了空间障碍，因而底物与效应物无法和酶接触，从而影响酶活性的一种效应。出现于包埋、吸附和共价结合法。构象改变、立体屏蔽2.分配效应•分配效应是固定化载体亲水、疏水性质对底物、产物在微环境和宏观体系之间发生的不等分配，从而改变酶反应系统组成的平衡而最终影响酶反应速度的一种效应。⑴载体与底物带相同电荷，Km’Km固定化酶降低了酶的亲和力。⑵载体与底物电荷相反，静电作用，Km’Km•上面的效应可以通过调节离子强度减弱而消除(3)采用疏水载体时，底物是极性物质，Km固定化后会升高。采用疏水载体时，底物是疏水物质，Km固定化后会降低。3扩散效应•外扩散：底物从液相主体向固定化酶的外表面扩散，或产物从固定化酶外表面向液相主体的扩散，外扩散发生在催化反应之前或之后。•内扩散：对一有微孔载体的固定化酶，底物从固定化酶外表面扩散到微孔内部，或产物沿相反途径扩散。对底物来说，内扩散与催化反应同时进行。二、酶固定化后的性质变化酶固定化后，原有的某些性状会产生一定变化。1对底物的特异性。对低分子底物作用变化不大，而对高分子底物的催化作用明显减弱。是由于载体的空间位阻引起的。2酶反应最适PH值的改变与载体性质有关3动力学常数的改变。米氏常数和最大反应速度会改变4酶反应温度的改变5增加酶的稳定性。对热、PH值、有机溶媒、蛋白质变性剂、蛋白质分解酶的稳定性增加。连续化反应稳定性好。——固定化酶的最大好处第五节固定化酶在工业生产上的应用乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸乙酰-D—AlaAminoacylase氨基酰化酶泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala固定化酶在医学上的应用（一）酶电极（1）葡