第五章-生物计量学与反应动力学

北京理工大学•生命学院孙立权[e-mail]第五章细胞反应过程的计量学与动力学细胞反应过程特点生物反应过程的计量学细胞生长动力学产物生成和基质消耗动力学基因工程菌发酵动力学分析细胞反应过程的计量学与动力学•反应主体是活的生命，能调节自己以适应环境变化（有氧和无氧）•代谢网络中包含上千个反应，机理复杂，常采用经验模型•速率间不象酶反应存在简单关系，因此须研究反应计量学。（常用速率：细胞生长、底物（氧〕消耗、产物（CO2）生成〕微生物反应的特点细胞反应过程特点生物反应过程的计量学细胞生长动力学产物生成和基质消耗动力学基因工程菌发酵动力学分析细胞反应过程的计量学与动力学1、研究计量学的目的及计量学特点•设计概算的基础•过程分析•计量的不确定性反应物———————————————→生成物(碳、氮、磷、(生物量、产物、硫等营养源及前体)付产物、能量)反应物的不确定性、细胞的不确定性、生成物的不确定性.生物反应是在生物体内通过生物代谢过程来实现的.谷氨酸脯氨酸1，3－丙二醇脂肪酸甘油丁二醇丙酮丁醇乳酸乙醛乙醇乙酸葡萄糖丙酮酸乙酰CoA柠檬酸α－酮戊二酸琥珀酸苹果酸草酰乙酸TCA循环天冬氨酸赖氨酸研究计量学的目的及计量学特点碳源能源、细胞材料中间产物丙酮酸构成细胞材料氨基酸、核苷酸等细胞ADPATPATPADPATPADP代谢产物乙醇、CO2最低培养基时微生物对碳源的利用异化（H）H2O厌氧好氧研究计量学的目的及计量学特点细胞材料氨基酸等中间产物丙酮酸细胞ATPADP代谢产物乙醇、CO2完全培养基时微生物对碳源的利用碳源能源ATPADP异化异化C2O研究计量学的目的及计量学特点2、细胞生长的测定和计量微生物生长的测定，通常是测群体的重量或细胞数，而不是测细胞个体的重量或大小。生长的测定常用理化方法，分为测定细胞数和细胞重量两类。⊙直接计数法细胞生长的测定和计量（生物量）培养计数法：在合适的培养基上用Petridishes培养，数菌落数。时间要20–30小时，计数为活细胞。CFU(Colonyformingunit)显微计数：计数器计数法在显微镜下用血球计数器直接数出酵母菌或霉菌孢子数目，以及用细菌计数片直接测出细菌数的生长Hemocytometer，血球计数板，数20格以上平均，10-4mL/格,以染色的方法可以区分活菌和死菌。细胞生长的测定和计量直接计数法⊙细胞干重的测量细胞干重：(g/L)，DCW(Drycellweight)，离心–烘干–恒重；80℃，24小时；110℃，8小时。浊度法：(Turbidity)常用波长500–700纳米，线性区为0.3~1吸光率单位。例如：某细菌悬浮液在520纳米测得光密度和干菌重的关系为：1.75OD相当于1mg/mL菌量。细胞生长的测定和计量•细胞堆积容积测量法用锥形刻度管测量经离心的细胞沉淀物的容积，由此间接表示细胞重量的生长•细胞组成分析法测定一种大分子的细胞组成(蛋白质、RNA、DNA等)，间接地算出细胞重量的生长其它测定方法细胞生长的测定和计量营养物消耗分析法测定培养基中不用于合成代谢产物的营养物（磷酸盐、硫酸盐等）的消耗，由此间接表示细胞重的生长产物重量分析法测定培养中途形成的二氧化碳，氢，ATP等产物，由此间接地换算出细胞重量的生长其它测量方法：菌体湿重，沉降高度等。其它测定方法细胞生长的测定和计量小结：直接测量法和间接测量法。细胞的组成和特性3、生物反应的计量式与元素平衡OdHcCOOHHbCaOOHC225226126是否可通过配平求得各计量系数？OHCOOOHC2226126666252612622COOHHCOHC维持生成产物x1-xOxHCOxOHHCxxOOHC2252261266)24()1(26x变化则计量系数改变，在发酵过程更常用得率概念。微生物反应过程中的质量衡算碳源＋氮源＋氧＝菌体＋有机产物＋CO2＋H2O为了表示出微生物反应过程中各物质和各组分之间的数量关系，最常用的方法是对各元素进行原子衡算。如果碳源由C、H、O组成，氮源为NH3，细胞的分子式定义为CHxOyNz，忽略其他微量元素P,S和灰分等，此时用碳的定量关系式表示微生物反应的计量关系是可行的。3、生物反应的计量式与元素平衡黑箱模型：基于元素平衡分析速率间关系•C:1=c+d+f•H:m+3b=c+xd+2e•O:n+2a=c+yd+e+2f•N:b=c+zd2232fCOOeHNOdCHNOcCHbNHaOOCHzyxnm6个待定计量系数，4个方程，自由度为2，已知2计量系数即可求出其它系数。须测定3个速率。若无产物，则由两个速率即可确定其它速率，但不是任意的两个速率（可观测性）。由c可确定a和f的值从而可得出呼吸熵与细胞得率的关系，对发酵过程状态检测很有意义。元素含量范围(%)平均含量(%)Carbon(C)45.0–49.047.0Hydrogen(H)5-76.0Oxygen(O)30-3532.5Nitrogen(N)7.1–10.88.5Totalash4.7–10.56.0Phosphate(asP2O5)1.9–5.52.6Potash(asK2O)1.4–4.32.5Calcium(asCaO)0.005–0.20.05Magnesium(asMgO)0.1–0.70.4Aluminium(asAl2O3)0.002–0.020.005Sulphate(asSO4)0.01–0.050.03Chloride(Cl)0.004–0.10.02Iron(asFe2O3)0.005–0.0120.007Copper(Cu)10–100p.p.m20p.p.mSilica(SiO2)0.02–0.20.08菌体的元素分析-酵母干物质中的元素百分组成菌体的化学式按照元素的百分组成并忽略灰份的存在，可以得到酵母菌的化学计量式如下：C3.92H6O2.03N0.61近似为C4H6O2N0.63、生物反应的计量式与元素平衡葡萄糖为基质进行面包酵母(S.cerevisiae)培养，培养的反应式可用下式表达，求计量关系中的系数a,b,c,d.223106326126)(3dCOOcHNOHbCaNHOOHC面包酵母22310632612612.332.4)(48.048.0312.332.448.0:23326:210312:66:][COOHNOHCNHOOHCdcbabaNdcbOcbaHdbC面包酵母系式为所以上述反应的计量关以上方程联立求解，得根据元素平衡式有：解配平微生物反应方程式时，一部分系数是由实验测得的，另一部分系数需计算获得。一般基质和产物的分子式是已知的。微生物细胞的元素组成可通过元素分析方法测定。通过测定O2的消耗速率与CO2的生成速率来确定好氧培养中评价微生物生物代谢机理的重要指标之一呼吸商：(respiratoryquotient,RQ))34(22消耗速率生成速率OCORQ[例]乙醇为基质，好氧培养酵母，反应方程式为呼吸商RQ=0.6。求各系数a,b,c,d,eOeHdCOONCHcbNHaOOHHC225.015.075.13252)(OHCOONCHNHOOHHCedcbaadRQcbNedcaOecbHdcC225.015.075.13252634.2436.1)(564.0085.0394.2634.2436.1,564.0,085.0,394.2)5(~)1()5(6.0,6.0)4(15.0:)3(25.021:)2(275.136:)1(2:所以，反应式为，式联立求解用即已知有【解】根据元素平衡式[例]葡萄糖为碳源，NH3为氮源进行酵母厌氧培养。培养中分析结果表明，消耗100mol葡萄糖和12molNH3生成了57mol菌体、43mol甘油、130mol乙醇、154molCO2和3.6molH2O,求酵母的经验分子式。。细胞的化学结构为由以上结果可知，酵母则则，则＋＋，则各元素平衡式为的反应方程式为【解】由题意写出相应52.021.084.12522353312652.0,6.3130215434357600:21.0,5712:84.126.36130843573121200:1213015434357600:6.3130154)(4357126100ONCHzzOyyNxxHwwCOHOHHCCOOHHCONHCNHOHCzyxw生化反应中的还原度物质中每个原子相对应的有效电子当量数一些元素的还原度：C＝4，H＝1，N＝-3，O＝-22232fCOOeHNOdCHNOcCHbNHaOOCHzyxnmsspsbacc41其中：s，b，p为底物、细胞、产物的还原度nms24324bzyxp324细胞反应过程中的得率系数得率：细胞反应过程中二变化速率之比22326126fCOOeHNOdCHNOcCHbNHaOOHCzyxstsxxtsxsxCCCCsxrrY00三种定义：对基质的得率系数22222222OCOOCOOOCqqOCOrrYRQstspptspspCCCCsprrY00•得率与计量系数关系为22,,OCOspspsxsxMMafQMMdYMMcYR单位为质量比•对碳的细胞得率sxsxsxcYsxYGsxYsx*介于0－1之间对基质的得率系数•理论得率：仅考虑细胞生长所消耗的基质细胞得率：消耗1g基质生成细胞的克数称为细胞得率或称生长得率Yx/s(cellyield或growthyield)。其定义式：SXYsx消耗基质的质量生成细胞的质量/细胞得率的单位是(以细胞/基质计)g/g某一瞬间的细胞得率称为微分细胞得率(或瞬时细胞得率)基质的消耗速率—微生物细胞的生长速率—式中：sxsxrrdtSddtdXrrSddXsYx)54)(/][/(][/细胞反应过程中的得率系数同一菌种，同一培养基，好氧培养的Yx/s比厌氧培养的大得多。另外同一菌株在基本、合成和复合培养基中培养所得Yx/s大小顺序为复合培养基、合成培养基、基本培养基。细胞反应过程中的得率系数当基质为碳源，无论是好氧培养还是厌氧培养，碳源的一部分被同化(assimilateoranabolism)为细胞的组成成分，其余部分被异化(dissimilateorcatabolism)分解为CO2和代谢产物。如果从碳源到菌体的同化作用看，与碳元素相关的细胞得率Yc可由下式表示：。实际就是中的系数。式，为值一般小于。量基质中所含碳元素量单位质量细胞和单位质—和式中：＝基质含碳量基质消耗量细胞含碳量细胞生产量ccccccsxcYCYSXSXYY)14(9.0~4.01)64(/细胞反应过程中的得率系数GsxYsx*理论得率：仅考虑细胞生长所消耗的基质葡萄糖为碳源，NH3为氮源，进行某种细菌的好氧培养，消耗的葡萄糖中有2/3的碳源转化为细胞中的碳。反应式为：222.186.03.74.4326126)(eCOOdHONOHCcbNHaOOHC计算上述反应中的得率系数Yx/s和Yx/o21224)(24487291.0)124.4(48)(483/2727212egCOcggmol所以的碳量为转化为所以，转化为细胞内的碳为葡萄糖中含有碳为【解】细胞反应过程中的得率系数)/)(/(77.13247.1(1.83/)/)(/(46.01801.83/)(1.83)162.11486.013.7124.4(91.0147.116162162.116216685.323.731278.01486.014氧计以细胞＝）葡萄糖计以细胞所以葡萄糖生成的菌体量消耗