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微生物工程实验报学院：生命科学学院专业：生物技术年级：学号：学生姓名：组别：第一组指导老师：郭旭辉老师时间：2012年6月15日1目录目录……………………………………………1摘要………………………..……………………2关键词………………..…………………………..2前言……………………..………………………3实验材料与方法……………………………………..5实验结果与分析……………………………………..8展望……..………………………………………..11附录………..……………………………………..12原始数据………………………………………….13参考文献………………………………………….142摘要：发酵工程属于生物技术的范畴，生物技术又称生物工艺学现代生物技术作为一门新兴的高科技术产业，在发酵技术中一般包括微生物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利用固定化酶，固定化细胞所做的反应器加工底物，以及培养加工后产物大规模的分离提取等工艺。主要是在生物反应过程中提供各种所需的最适环境条件。试验采用L1523小型发酵罐对枯草芽孢杆菌进行发酵生产，发酵液为液体牛肉膏蛋白胨培养基。运用吸光光度法来表示生物量，绘制此过程枯草芽孢杆菌的生长曲线，通过革兰氏染色确定芽孢产生情况，确定放罐时间等。Abstract:Fermentationengineeringaretheareasofbiotechnology,biotechnology,alsoknownasbiotechnology,modernbiotechnologyasanewHigh-TechIndustry.Infermentationtechnologyingeneral,includingmicrobialcellsoranimalandplantcellsuspensionculture,ortheuseofimmobilizedenzyme,theimmobilizedcellreactormadeprocessingofthesubstrate,aswellasaproductofthecultureafterprocessinglarge-scaleseparationandextractionprocess.Mainlyprovideallthenecessaryoptimumenvironmentalconditionsinthebioreactorprocess.UsingL1523smallfermentationtankfermentationofBacillussubtilisfermentationbrothfortheliquidbeefextractpeptonemedium.ThenusingphotometricmethodtorepresentthebiomassthisprocessisthegrowthcurveofBacillussubtilis,GramstaintodetermineBacillusproduceasituationtodeterminethetimeofthereleasetank.关键词：发酵工程、生物技术、分离、提取Keyword：Fermentationengineering、biotechnology、separation、extraction3前沿：发酵工程（FermentationEngineering）属于生物技术的范畴，生物技术又称生物工艺学现代生物技术作为一门新兴的高科技术产业，它的生命力在于他对社会经济和发展的各个方面都带来了极大冲击和影响。发酵工程是指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的技术。发酵工程由于涉及到生物催化剂，因而与化学反应有关。由于生物技术的最终目标是建立工业生产过程为社会服务，因而该生产过程可称为生物反应过程（亦称为生化反应过程）。在发酵技术中一般包括微生物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利用固定化酶，固定化细胞所做的反应器加工底物（即有生化催化剂参加），以及培养加工后产物大规模的分离提取等工艺。主要是在生物反应过程中提供各种所需的最适环境条件。如酸碱度、湿度、底物浓度、通气量以及保证无菌状态等研究内容。生物技术产品具有多样性，各个学校的教学资源和课时不同，所进行的实验种类不同。本实验内容根据本校的具体条件进行安排。安排的思路是以最简洁有效的方式针对发酵过程的重要要素进行实验，便于学生对教学内容有个较好的认识，理顺学习思路，为进行社会科学实践打下良好基础。小型发酵罐是实验室进行小规模试验研究的必备装置，瑞士比欧生物工程公司生产的L1523型小型发酵罐主要由罐体、通气系统、搅拌系统、加热及控温系统、监测及控制系统等几个部分组成。罐体：罐体是发酵生产微生物菌体或代谢产物的场所，一般由不锈钢、陶瓷或特种玻璃制成，其体积根据需要可从0.1升到100升不等。L1523型发酵罐的体积为19升，发酵罐的外形由罐盖、罐体和罐底组成。罐盖：由耐腐蚀的不锈钢构成，其上有十二个圆孔，分别用于安装pH探头、温度探头、溶解氧探头、气压表、调节pH的补酸、补碱管、排气管过滤器、通气管、放样管和安全阀，靠近外侧的两个孔一般用塞子塞住，主要用于接种、加消泡剂等。罐体：由耐高温、高压的特种玻璃制成，其内4有各种探头、通气管、放样管、搅拌器和挡板等。罐底：由具夹层的不锈钢制成，夹层内与加热器和冷却水联通，通过此夹层与发酵罐进行热交换，以控制罐内温度。搅拌器也是通过罐底进入罐体的，称为下搅拌，此外在罐底还有空气分布器，能使压缩空气均匀分布于发酵罐中。通气系统：L1523型发酵罐适用于好气性微生物的发酵生产，其空气来源于空气压缩机。由空压机压缩的高压空气经除油、除水和减压装置减压后，通过预先灭菌的空气过滤器过滤除菌，然后再经空气分布器、搅拌器和挡板等的共同作用，使无菌空气均匀地分布到整个发酵罐。搅拌系统：发酵罐的搅拌装置可分为上搅拌和下搅拌两种类型，L1523型发酵罐属于下搅拌，其搅拌器由搅拌电机驱动，转速高达1000rpm。加热与控温系统：L1523发酵罐为原位灭菌发酵罐，利用自带的小型加热器(锅炉)，可进行培养基的灭菌和保温，再借助于冷却水(自来水)可使发酵罐内的灭菌温度和发酵温度精确地保持恒定(误差为±0.1℃)。监测及控制系统：小型发酵罐一般都配备有监测控制系统，可以监测和控制搅拌器的转速、灭菌和发酵的温度、pH值、溶解氧量等。L1523型发酵罐可通过计算机实现自动控制，中间可借助蠕动泵和补料系统自动补料和调节pH值等。5正文：一、实验材料与方法1、实验材料1.1菌种枯草芽孢杆菌V1J，黑曲霉菌株1.2培养基1.2.1斜面菌种培养基牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，水1000ml，pH7.2~7.4，0.1Mpa，121℃，灭菌30min。配制500ml固体培养基，分装入20支15×150mm试管(每管约5ml)和3个250ml三角瓶中，包装、灭菌。试管摆成斜面。1.2.2三角瓶种子培养基牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，水1000ml，pH7.2~7.4，0.1Mpa，121℃，灭菌30min。配制液体培养基1000ml，分装到10个250ml三角瓶中，每瓶100ml，灭菌。1.2.3PDA培养基的制备称取去皮马铃薯200g，切片，放入小锅中，加入1000ml水，加热煮沸10—15分钟，用8层纱布过滤。取滤液加入蔗糖20g、琼脂20g，加热熔化后补足水分（自然pH），然后分装到20支15×150mm试管（5ml/支）和6个250ml三角瓶（150ml/瓶）中，于0.1Mpa，121℃灭菌30min。1.3试剂及药品马铃薯、葡萄糖、琼脂、蛋白胨、牛肉膏、蒸馏水、NaCl、NaOH、H2SO4、酒精（75%和95%各一瓶）、消泡剂（豆油）、沙黄、孔雀绿等2、方法2.1灭菌剂实验前准备2.1.11ml无菌吸管：每组30支，于0.1Mpa，121℃灭菌30分钟。2.1.2无菌水：18×180mm试管，每支装9ml水，每组40支，于0.1Mpa，121℃灭菌30分钟（作标准曲线10倍稀释法用）；另配3-5个三角瓶无菌水（总1升）；另配10余支4.5ml15×150mm(稀释、抑菌试验作对照，洗菌（枯草芽孢杆菌洗菌接种、黑曲霉洗菌涂布等）。2.1.3无菌培养皿：每组40套，于0.1Mpa，121℃灭菌30分钟。2.1.4无菌大试管（18×180mm试管）：每组20个，于0.1Mpa，121℃灭菌30分钟。主要用于发酵液取样方便，量足，取样时接近1/2。不够再灭菌使用。2.1.5无菌吸管（可用无菌枪头取代，用于吸少量液体涂布和作抑菌试验等）：1ml吸管，每组20支，于0.1Mpa，121℃灭菌30分钟。2.1.6空气过滤器的灭菌：空气过滤器针尖先用纱布包扎好，然后再用包装纸和6绳子将空气过滤器整体包装好，于0.1Mpa，121℃灭菌30分钟。2.1.7牛津杯的灭菌：将36只牛津杯装入培养皿中，每皿10只，用包装纸包装好，于0.1Mpa，121℃灭菌30分钟。2.1.8消泡剂的灭菌：量取100ml豆油倒入250ml三角瓶中（每组3~4瓶），包装好后于0.1Mpa，121℃，灭菌30分钟。2.1.91NH2SO4和1NNaOH溶液灭菌，用来调节发酵过程中的pH。配制75%和95%的酒精棉球各一瓶2.2培养方法2.2.1斜面菌种的培养将已活化两次的试管斜面菌种接种到牛肉膏蛋白胨试管斜面上，30℃培养18~20小时，即为斜面菌种。2.2.2种子液的制备将试管斜面用4.5ml无菌水洗下，然后接种到250ml三角瓶培养基中，每瓶一管，接三瓶，于30℃，150rpm条件下，振荡培养18~20小时（一级种子）。由三角瓶移接入另外500ml三角瓶（或更多的250ml三角瓶）中扩大培养（此为二级种子），保证二级种子接种量7-10%（如13L发酵液则为910-1300ml左右，其中还包括预留一部分作标准曲线用）。2.2.3发酵生产2.2.3.1细菌细胞浓度的测定（比浊法）2.2.3.2标准曲线的制作取无菌水9支，编号，将在30℃、150rpm条件下培养20~22小时的枯草杆菌细胞按二倍系列稀释法进行适当稀释，使其浓度分别为原液、1/2、1/4、1/6、1/8、1/10、1/12、1/16、1/32、1/64原液，同时以无菌水作为空白对照，利用分光光度计测定其在580nm波长下的O.D.值，并求出原液OD值的平均值；然后，采用平板菌落计数法（注意：这是十倍稀释法）测定其中的细胞数量（大约10-6、10-7、10-8，如太浓则10-7、10-8、10-9，每一个梯度用三个重复），换算出原液细胞数量的平均值。（注：为保证标准曲线成功率，加之不知何种浓度稀释适于涂布平板计数，建议学生10-5、10-6、10-7、10-8、10-9各个梯度各3个重复，如果还不成功，则可减少梯度，如选10-6、10-7、10-8三个梯度3重复再作一次，具体情况视前面平板的菌落长相而定其梯度，但保证三个重复以保证其成功率）。以O.D.值作为纵坐标，每ml样品中的细胞数作为横坐标，曲线换算，绘制标准曲线。2.2.3.3发酵液细胞浓度的测定从取样管放出10ml左右的发酵液至无菌大试管（18×180mm试管）中，在580nm波长下，测定发酵液的O.D.值，对照标准曲线，可知该发酵液的细胞浓度。2.2.3.4发酵培养基的灭菌每组配制13L牛肉膏蛋白胨液体培养基（pH7.4），另再加0.1%的酵母膏，用乳胶管小心地加入发酵罐中，然后旋紧塞子，安装好防护罩，按下面的方法灭菌：7（1）检查水、电、气以及发酵罐的密封性是否正常。如正常即可灭菌。（2）打开进水阀，调节水压使水压表指针指示在0.2~0.4之间，使水充满加热器，防止烧坏加热器。（出水阀近关闭情况下，达到0.4，此时出水阀虽然关闭，但进水阀打开，此外水压也满足要求，所以水能充满加热器不至于烧坏，当灭菌结束降