第六章--灭菌动力学

北京理工大学•生命学院孙立权[e-mail]第六章灭菌动力学灭菌动力学灭菌概述高温灭菌动力学液体介质的灭菌方式空气灭菌染菌的危害01概述1、由于杂菌的污染，使生物反应中的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降；2、由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化性质，使产物的提取和分离变得困难，造成收率降低或使产品的质量下降；3、杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的PH值，从而使生物反应发生异常变化；4、杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败；5、发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败，等等。染菌原因种子培养基空气系统取样设备（阀门、焊接）其它01概述国内一制药厂发酵染菌原因的分析染菌原因百分率，%外界带入杂菌（取样、补料带入）8.20设备穿孔7.60空气系统带菌26.00停电罐压跌零1.60接种11.00蒸汽压力不够或蒸汽量不足0.60管理问题7.09操作违反规程1.60种子带菌0.60原因不明35.0001概述大批发酵罐染菌：空气系统部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的个别发酵罐连续染菌和偶然染菌：设备问题01概述染菌原因分析------从染菌的规模来分析1）发酵早期染菌可能是从种子中带入，或由于培养基灭菌不彻底，或设备有“死角”，清洗不干净而染菌。2）发酵中后期染菌可能是无菌空气或中间补料带入杂菌，或发酵设备渗漏，以及操作不合理逐渐侵入杂菌而造成的。01概述染菌原因分析------从染菌的时间分析耐热性芽抱杆菌：可能是由于原料中原有的芽孢未能杀灭，或者死角或灭菌不彻底。球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的，或者设备渗漏。浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌)：发酵罐的冷却管或夹套渗漏霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格噬菌体：很可能是空气系统，特别是在大风天气后。01概述染菌原因分析------从染菌的类型来分析消毒与灭菌的区别？消毒与灭菌在发酵工业中均有广泛应用。消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，用于消牛奶、啤酒和酿酒原汗等的巴氏消毒法，是将物料加热至60维持30min，以杀死不耐高温的物料中的微生物营养细胞。灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。01概述1、化学试剂灭菌法化学试剂：甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等适用范围：环境空气、皮肤及器械的表面消毒2、射线灭菌法3、干热灭菌法电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：无菌室、接种箱常用烘箱，灭菌条件为在160℃下保温1h适用范围：金属或玻璃器皿4、湿热灭菌法利用饱和蒸汽进行灭菌、条件为：121℃，适用范围：30min，广泛应用于生产设备及培养基的灭菌例：高压灭菌锅5、过滤除菌法利用过滤方法阻留微生物适用范围：制备无菌空气热死时间：即在规定温度下杀死一定比例的微生物所需要的时间。致死温度：杀死微生物的最低温度（同最高生长温度）。致死时间：在此温度下，杀死全部微生物所需要的时间。热阻：对热的抵抗力，指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻：微生物对热的相对抵抗能力。指微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。01概述衡量热灭菌指标灭菌方式大肠杆菌霉菌孢子细菌芽孢噬菌体或病毒干热灭菌12-1010001湿热灭菌12-103×1051-5苯酚11-21×10930甲醛12-102502紫外线15-1002-55-10微生物的相对热阻。01概述02高温灭菌动力学微生物的死亡速率：对数残留定律在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌，广泛使用湿热灭菌法。工厂里，蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。微生物受热死亡的原因，主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论。在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残留活菌数的减少而递减，即微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，湿热灭菌的方法处理培养基，其加热受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成，所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾，恰当掌握加热受热时间是灭菌工作的关键。微生物的死亡速率：对数残留定律02高温灭菌动力学对数死亡模型dRNNdk02高温灭菌动力学KNdtdN微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比N—残存的活菌数；t—灭菌时间（s）；K—灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；dN/dt—活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。微生物的死亡速率：对数残留定律02高温灭菌动力学ktteNN0NtNKNtNKt00lg303.2ln1灭菌速度常数K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。各种微生物在同样的温度下K值是不同的，K值愈小，则此微生物愈耐热。式中：N0—开始灭菌（t=0）时原有活菌数；Nt----经时间t后残存活菌数。微生物的死亡速率：对数残留定律02高温灭菌动力学在121oC，枯草杆菌FS5230的K为0.047s-1，梭状芽孢杆菌PA3679的K值为0.03s-1，请问哪一种微生物更耐热？NtNKNtNKt00lg303.2ln1从上述的微生物对数死亡规律和非对数死亡动力学模型方程式可知，如果要达到彻底灭菌，即灭菌结束时残留的活微生物数等于0，则灭菌所需的时间应为无限长，这在实际中是不可能的。微生物的死亡速率：对数残留定律02高温灭菌动力学大肠杆菌在不同温度下的死亡曲线10t(min)N/N010-110-210-310-424681060585654嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线10t(min)N/N010-110-210-310-45101520251211161101081051）如微生物存在芽孢，其死亡速率呈现非对数死亡定律2）工程上，在进行灭菌的设计时，常染菌概率为0.001，即在1000次灭菌中，允许有一次失败。微生物的死亡速率：对数残留定律02高温灭菌动力学当培养基被加热灭菌时，常会出现这样的矛盾：加热时，微生物固然会被杀死，但培养基中的有用成分也会随之遭到破坏实践证明，在高压加热的情况下，培养基中的氨基酸和维生素极易被破坏，如在121℃，仅20min，就有59%的赖氨酸和精氨酸及其他碱性氨基酸被破坏，蛋氨酸和色氨酸也有相当数量被破坏。因此，必须选择一个既能满足灭菌需要，又可使培养基的破坏尽可能养活的灭菌工艺条件。微生物的死亡速率：灭菌的温度和时间02高温灭菌动力学)exp(RTEAKA---频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1；R---气体常数，8.314J/mol·K；T---绝对温度，K；ΔE---微生物死亡活化能，J/mol。或培养基成分分解所需活化能K—灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数.或培养基内易被破坏成分的分解速率常数微生物的受热死亡属于单分子反应，其灭菌速率常数K与温度之间的关系可用阿伦尼乌斯公式表示：从上式可知，K值的大小与微生物或营养成分的种类与加热温度有关微生物的死亡速率：灭菌的温度和时间02高温灭菌动力学部分物质的失活(分解)活化能微生物的死亡速率：灭菌的温度和时间02高温灭菌动力学```lnln1212EEKKKK）（）（微生物的死亡速率：灭菌的温度和时间02高温灭菌动力学当培养基成分从T1上升到T2时，微生物的死亡速率与营养成分的分解有如下关系：灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分的破坏活化能值，因此：）（）（1212``lnlnKKKK即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分的破坏速率的增加倍数。从上述的分析可知，在热灭菌过程中，同时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程的进行速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温度的升高更为显著。因此，可选择合适的灭菌温度和时间来调和二者之间的矛盾。微生物的死亡速率：灭菌的温度和时间02高温灭菌动力学微生物的死亡速率：灭菌的温度和时间02高温灭菌动力学灭菌温度、时间与营养成分破坏量的关系（N/No=10-16）VB1灭菌温度℃灭菌时间（分）营养成分破坏量%10040099.31103667.01151550.0120427.01300.58.01450.082.01500.011.0灭菌温度、时间与营养成分破坏量的关系（N/No=0.001）微生物的死亡速率：灭菌的温度和时间02高温灭菌动力学影响灭菌的因素培养基成分培养基的物理状态培养基的pH值培养基中的微生物数量微生物细胞中水含量微生物细胞菌龄微生物的耐热性空气排除情况搅拌泡沫微生物的死亡速率02高温灭菌动力学高温灭菌，重点是芽孢DkskNNsrRNRRNNCdtdCrkt))exp(--t)(exp(CCCCCN0NNN0NRSrrsssrrkkkkkkk循序死亡模型（芽孢）SRSNNNCCdtdCsrkk02高温灭菌动力学02高温灭菌动力学000000.50.0041750.0083680.7985076964.762799110.0125790.042561.6094379129.52619331.50.0469172.3895964714.42861520.02960.0824763.19316746830.0339020.1007424.78250420140.0512930.1240536.29934932760.0870110.2076399.6033829680.0915670.2495312.7623606490.1053610.293253NtNKNtNKt00lg303.2ln18590110120y=0.0122xR2=0.977100.020.040.060.080.10.120246810y=0.0326xR2=0.991700.050.10.150.20.250.30.350246810y=1.5943xR2=0.9999024681012140246810y=9.5859xR2=0.9999024681012141600.511.52tt0lnNN解：：通过作图可得不同温度下比死亡速率常数。介质的批式灭菌灭菌标准：染菌概率为0.01或0.001存在一个活细胞或活孢子将引起染菌03液体介质的灭菌方式Del系数，Nabla系数和灭菌标准03液体介质的灭菌方式介质的批式灭菌解：N0=40×106×2×105=8×1012（个）Nt=0.001（个）K=1.8min-1NtNKNtNKt00lg303.2ln1(min)34.20)108lg(8.1303.2lg303.2150NtNKt例：有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每1mL有2*105个耐热细菌芽孢，121度时灭菌速度常数为1.8min-1。求灭菌失败机率为0.001时所需要的灭菌时间。介质的批式灭菌03液体介质的灭菌方式灭菌温度高，保温时间短灭菌设备复杂，投资大设备灭菌与介质灭菌分别进行特点：介质的连续灭菌03液体介质的灭菌方式预热－加热-维持（holding）-冷却短时间液急速升温，灭菌后的培养基急速冷却。该流程中培养基受热时间短，营养物质的损失也就不很严重，同时该流程保证了培养基物料先进先出，避免了过热或灭菌不彻底等现象。介质的连续灭菌03液体介质的灭菌方式该流程的加热和冷却时间比喷射加热连续灭菌流程要长些，但由于在培养基的预热过程同时也起到了灭菌后培养基的冷却，因而节约了蒸汽和冷却水的用量。介质的连续灭菌03液体介质的灭菌方式介质的连续灭菌03液体介质的灭菌方式间歇灭