第七章--生化反应器-氧传递的

北京理工大学•生命学院孙立权[e-mail]第七章生化反应器分析与设计生物反应过程中的重要参数及参数相关性分析原理生物反应器中影响过程的不同层次基因细胞反应器微生物过程曲线图SugarconsumptionpHTemperatureAgitationCellDryWeightProduct1概述生产管理：最佳的操作点或部分参数的时序变化规律过程动力学：动态性，强调参数各自的时序变化，缺少相关分析或对过程内在联系缺乏了解，难以直接用于过程优化过程多尺度系统理论：分析测得的环境中的状态或操作量，得到反映分析、细胞和反应器水平的不同尺度的联系、进行跨尺度操作。过程曲线1概述发酵过程的混沌现象测量技术精度和漂移细胞代谢对环境因子的高度敏感性和细胞代谢的不可逆性基因水平的启动和表达系统的多态性和不稳定性，参数的不确定性参数耦合相关：各种直接参数、间接参数以及实验室手工参数随着发酵过程的进行而变化，并且参数间发生某种耦合相关1概述1概述常测量的参数包括：细胞量（测定方法）DOKLaOURCERRQ转速流速（气体、料液）黏度2生物反应体系中氧传递氧是影响、限制微生物正常生长代谢的关键因素•用量大：完全呼吸氧化1mol（180g）葡萄糖需要6mol（192g）氧气。•溶解度低：常温常压下约10ppm，氧的溶解度仅约为葡萄糖的1/6000•传递过程复杂：氧气从气体到被微生物利用需要经历复杂的多相传递过程•氧供应不足可能对细胞产生不可恢复的伤害：导致细胞代谢途径变化，使得细胞密度、产物浓度降低。氧从空气泡到达细胞内的示意图气-液接触界面附近氧浓度分布高细胞密度发酵中的供氧和传氧问题Solubilityofoxygenvstemppartialpressureofoxygenis1atm2.181.71.541.381.261.161.091.0300.511.522.501020304050Temp(C)Solubility(mmole/L)系列12.1反应体系中的氧平衡临界溶氧2.1反应体系中的氧平衡2.1反应体系中的氧平衡细胞种类温度(℃)Ccr(molm-3)发光细菌240.01维涅兰德固氮菌300.018～0.049大肠杆菌37.80.0082160.0031粘质沙雷氏菌310.015脱氮假单胞菌300.009酵母34.80.0046200.0037产黄青霉菌240.022300.009米曲霉360.020肾脏片370.85一些细胞的临界氧浓度Ccr2.2影响气液氧传递速率的因素CKCqqOmOO)(22)()(**LLLLCCakCCaKOTR•氧的溶解特性氧在培养液中的溶解度C*。温度升高，溶解度逐渐下降。氧在一些有机化合物中的溶解度比在水中大。在电解质溶液中，由于盐析作用，氧的溶解度降低。在培养过程中，培养液的组成是变化的，其溶氧也变化。•影响推动力的因素一般来说，培养液中的溶质浓度越高，氧的溶解度越低，氧传递的推动力就越小。提高气相中氧分压可以提高液相氧的平衡浓度C*提高反应器中的压力，但二氧化碳的分压也升高增加空气中氧的相对含量•气液比表面积α气液比表面积与气体存留率成正比，与气泡平均直径成反比•体积传递系数KLa及其测定sgLvVPKaK)/(Pg为通气功率，V为反应器体积，vs表观气速，α、β为指数；K为有因次的系数操作条件流体性质：培养基组成、细胞浓度及形态表面活性剂：培养液中的蛋白质、脂肪及化学消泡剂等使比表面积a增大增大了传质阻力，又使KL下降盐浓度：电解质溶液中，气泡直径比在水中小得多，因而有较大的比表面积传氧系数的测定--平衡法进行计算需要测量哪些量?2.3传氧系数的测定ALONCCakxq)(*2)//(10x7.325IIIIOOOOLATyPQTyPQVNmeanLCCaklog*A)(N)()(ln)()()(****log*LOLILOLImeanCCCCCCCCCCQ：体积流量（L/min）P：压力(atm)y：摩尔分率T：温度传氧系数的测量--动态法动态法是通过过程的研究，以较少的测定量获得更多的信息。risqO2inthisequation.rXCCakdtdCLLL)(*)(1*dtdCrXakCCLLL2.3传氧系数的测定动态法测量传氧系数时间曲线2.3传氧系数的测定--动态法rXCCakdtdCLLL)(*)(1*dtdCrXakCCLLLrX+dCL/dt2.3传氧系数的测定--动态法rXCCakdtdCLLL)(*)(1*dtdCrXakCCLLL测定常用1NNa2SO3溶液，用Co2+或Cu2+为催化剂。由于反应进行的很快，所以溶液中的溶氧浓度为0。碘量法测定Na2SO3浓度，即可求得传氧速率传氧系数测量法--化学法在发酵罐中加入具有还原性的化合物溶液通气使其氧化，测量溶液浓度的变化，计算氧的消耗量和传氧系数。2.3传氧系数的测定42232SONaO21SONa*LaCKOTR2.4反应器中的传氧效果2.4.1摇瓶发酵传氧系数2.4.1摇瓶发酵传氧系数2.4.1摇瓶发酵传氧系数2.4.1摇瓶发酵传氧系数发酵罐传氧系数的实验结果2.3.2机械搅拌发酵罐传氧系数常见的计算公式kLa=K(Pg/VL)(Vs)CooperetalkLa=K(Pg/VL)0.95(Vs)0.67kLa=K(Pg/VL)0.4Vs0.5N0.5RichardskLa=(+Ni)(Pg/VL)0.77Vs0.672.4.2机械搅拌发酵罐传氧系数氧传递效率的比较2.4.2机械搅拌发酵罐传氧系数①采用氧载体。主要是有机物，它们一般常温为液体，氧的溶解度高，包括全氟化碳、正十二烷、油酸、硅油等；②加入电子受体来代替氧气，如对苯醌、维生素K3衍生物；③通过基因克隆的方法在细胞中表达携带氧的蛋白如血红蛋白，以提高细胞的摄氧能力；④利用化学或生物方法产生内源氧。如在发酵液中加入分子氧底物如H2O2，通过过氧化氢酶催化分解H2O2产生O2；与藻类细胞共培养，藻类细胞释放氧气，这样可以建立一个人工体系提高系统供氧能力。2.5改善发酵过程中的氧传递提高传氧效率的选择提高通气量提高搅拌转速提高罐压提高氧分压增加两相接触面积改变搅拌与挡板的设计加氧携带剂(Oxygencarrier)改变细胞的摄氧能力2.5机械搅拌发酵罐传氧系数Tyree和Webster（1978）在专性好氧的透明颤菌(Vitreoscillasp.)中发现了血红蛋白。它与氧结合力强，能降低该菌的需氧量，在缺氧条件下能大量合成，是一种氧调节、氧结合的蛋白。依靠本身的启动子(P-vgb)转录透明颤菌血红蛋白的组成是：两个相同的分子量为15775的亚基和两个ｂ型血红素(b-Haem)，其光谱学性质及氧合动力学与氧合肌红蛋白、氧合血红蛋白等非常相似透明颤菌血红蛋白的远端血红素空穴的构象因受Ｅ螺旋和Ｆ螺旋构型的干扰而剧烈改变。2.6利用透明颤菌血红蛋白改善发酵过程氧的供给利用透明颤菌血红蛋白提高发酵产量细胞产物或活性物质VHb效应DO饱和度Escherichiacoli总细胞蛋白2.2倍2%α-淀粉酶增加3.3倍2%氯霉素乙酰转移酶活性增加80％2%半乳糖苷酶活性增加40％5%PHB占细胞重量的98％5%Bacillassublilis中性蛋白酶活性增加30％5%Crovnebateriumglutamicun赖氨酸增加24％～30％5%Xanthonasmaltophilia降解安息酸细胞量提高15％-Steptomycesavermitilis阿维霉素--Steptomycescolicolor放线菌素增加10倍2%Steptomyceslividans菌体增加50％5%Acremoniumchrysogenum头孢霉素增加2.2倍2%Saccharomycescerevisia细胞增加3倍5%Saccharomycessp.D-阿拉伯糖提高13.9％-CHOERO增加40％～100％2%粘度产物形成生长形态学设计，经济产物分离和回收泵输送，加热、冷却固液分离发酵过程微生物分布、营养供给、溶氧浓度(受空气分布、聚集、混合和温度等的影响)原料配制泵输送，加热、冷却固液分离流变学特性液体力学/动力需求热量传递质量传递粘度对各工艺阶段的影响2.6发酵液流变学特性各种流变学类型的流体Binghamplasticfluide00n=1Cassonfluide00n1Dilantfluide0,=0n1Newtonianfluide0,=0,n=1Pseudoplasticfluide0,=0,n10,n1速率梯度，切变率剪应力dxd牛顿流体K0非牛顿流体2.6发酵液流变学特性a表观粘度影响发酵介质特性的因素：培养基组成：玉米浆，麸皮细胞浓度细胞形态：细菌、真菌胞外产物：小分子，大分子)5.21(Ls2.6发酵液流变学特性由物质理化变化所引起的参数相互关联物理过程：物质或能量传递、混合、搅拌转速、通气流量、罐压力等化学过程：酸碱加入以及由此形成的物理化学现象等理化相关对不同细胞对象具有同一性，不会因为细胞生理活性的变化呈现不同的理化相关特性3发酵过程的理化相关3.1传热与酸碱反应温度控制、pH调节等3.2搅拌引起的DO变化发酵过程改变搅拌转速引起的溶氧饱和度的变化发酵过程中搅拌转速改变引起的DO变化3发酵过程的理化相关3.3通气流量变化与相关的物理过程：DO上升、CO2浓度下降、pH变化通气流量变化与相关的物理过程DO上升、CO2浓度下降、pH变化（CO2引起）通气量增加引起的pH变化3发酵过程的理化相关3.4罐压变化与DO3.5消泡剂及相关理化参数注意误操作引起的罐压变化和罐压波动引起的DO变化3发酵过程的理化相关3.6测量技术的操作条件在参数测量时，传感条件可能引起测量值的变化温度变化DO变化代谢测量值的漂移pH在线离线温度CO2释放假相关：如Kla的测量由排气氧浓度、通气流量、DO响应、发酵液体积等数据计算3发酵过程的理化相关4发酵过程的生物相关通过生物细胞的生命活动所引起的参数之间的耦合相关方式：1.通过生物细胞生长代谢后引起的培养液物性的变化，进而引起的参数相关2.通过生物细胞代谢途径的不同所引起的活性变化，直接对控制对象特性发生影响4.1菌体生长导致发酵液物性形变化及其参数变化菌体生长与KlaDO的相关图4-7图4-8(1)菌体生长以KLa、DO的相关特性4发酵过程的生物相关4.1菌体生长导致发酵液物性变化及其参数变化头孢霉素C发酵不同搅拌转速对Kla的影响菌丝形态(1)菌体生长与KLa、DO的相关特性PMV：离心压缩体积4发酵过程的生物相关(2)菌体生长与培养液的流变学特性流变学特性细胞浓度细胞形态菌体刚性菌丝呈团呈团流变性好功耗少通气量小过大氧扩散限制4.1菌体生长导致发酵液物性变化及其参数变化4发酵过程的生物相关(3)泡沫与KLa的关系表面活性物质形成表面张力增加泡沫形成消泡剂加入泡沫消除a下降KlaDO下降适当的保留泡沫可以提高DO4发酵过程的生物相关4.1菌体生长导致发酵液物性变化及其参数变化青霉素发酵过程加油所引起的DO值波动(4)搅拌与DO组成的控制回路特性耗氧率和基础转速大，放大系数小，DO对搅拌转速变化不敏感耗氧率和基础转速小，放大系数大，DO对搅拌转速变化敏感08.1KK回路的放大系数；为摄氧率；0为基础转速，、、常数单位转速增量引起的DO变化称为搅拌转速与DO组成的控制回路的放大系数发酵初期，改变搅拌转速控制DO易振荡4发酵过程的生物相关4.1菌体生长导致发酵液物性变化及其参数变化4.2代谢特性及其参数相关指当细胞由于代谢活性变化而直接引起的某些测定参数的变化，是发酵过程控制中最重要的相关代谢活性（代谢强度、代谢途径--代谢消耗不同、代谢产物不同）•环境条件的线性或动力学因素•胞内调节因子引起的代谢